Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
пентане. Приведенная на рис. 2,6 схема лишь приблизительно отражает
изменение элюирующей способности смесей растворителей. Окончательный
выбор состава элюента должен быть проведен более тщательно, с тем чтобы
была достигнута необходимая величина k. Изменение элюирующей способности
на 0,05 (по шкале иа рис. 2.6) приводит к 3-4-кратному изменению
коэффициента емкости, поскольку k зависит от элюирующей способности по
логарифмическому закону. Однако не следует удивляться тому, что
селективность разделения при использовании элюентов, содержащих
эквивалентные объемы пентана и дихлорметана или пентана и 1%
ацетонитрила, может различаться. Селективность разделения при элюировании
смесью сильно отличающихся по полярности растворителей обычно бывает
лучше, тогда как воспроизводимость результатов лучше при элюировании
смесью с эквивалентным по объему соотношением компонентов.
Хроматографическая колонка 39
Рис. 2.7. Влияние концентрации воды в элю-еите на разделение стероидов
[34]. Неподвижная фаза: сфе-рисорб; элюент: дихлор-метан с контролируемым
содержанием воды; проба: 1 - инертное соединение; 2 - холестенон, 3 -
прогестерон, 4- 17-ме-тилтестостерон, 5 - эсте* рон, 6 - 17-гндроксипро-
гесгерон" 7 - эстрадиол, 8 - преднизолоя.
2.2.3.3. Влияние воды. Добавление полярных соединений в элюент
сильно влияет на удерживание и селективность, даже если концентрации
таких добавок очень малы: например, на уровне растворимости воды в "-
гептане (<10-2%) илн в дн-хлорметане (<0,2%). Столь небольшие изменения
состава элюента, трудно поддающиеся определению и контролю, оказывают
влияние на удерживание и селективность. В работе [34] описана система
контроля за содержанием влаги в потоке, предназначенная для определения
содержания влаги в элюен-те, контроля содержания и поддержания его на
требуемом уровне. Влияние влаги особенно сильно выражено для неполярных
элюентов, а по мере увеличения полярности (увеличения растворимости воды
в элюенте) оно сказывается все слабее. Содержание воды в дихлорметане
определяют титрованием по методу Карла-Фишера. Добавки воды в пределах
нескольких 10~4 %
40 Глава 2
не оказывают влияния на абсолютное и относительное удерживание. Рис. 2.7
иллюстрирует влияние концентрации воды в дихлорметане на разделение
стероидов. В зависимости от поставленной перед аналитиком задачи
оптимальное разделение можно получить при высоком или низком содержании
воды. Чтобы избежать проблем, связанных с использованием воды,
рекомендуется заменить воду на метанол или другие спирты. Однако
приготовление и хранение таких элюентов сопряжено с определенными
трудностями (например, испарение спирта), причем влиянием содержания воды
на результаты разделения нельзя пренебречь и в этом случае [35]. Следует
учитывать, что, если результаты разделения зависят от содержания в элю-
енте воды или спирта, селективность может существенно различаться, даже
если коэффициенты емкости в обоих случаях одинаковы.
2.2.3.4. Распределение. Для нанесения на активный носитель различных
количеств неподвижной жидкой фазы можно воспользоваться следующим
приемом: дать уравновеситься концентрациям полярного соединения, например
воды или спирта, растворенного в элюенте и адсорбированного на полярной
неподвижной фазе. В результате колонка, заполненная активным носителем,
будет трансформирована в колонку для распределительной хроматографии. Для
получения распределительных хроматографических систем необходимы высокие
концентрации полярных добавок. Это единственный способ, позволяющий
нанести необходимое количество неподвижной жидкой фазы на полярное
твердое вещество in situ в уже упакованных колонках [36, 37].
Для получения распределительных систем с полярными твердыми фазами
рекомендуются тройные смеси растворителей [38], состоящие из неполярного
элюента (например, гептана или дихлорметана), сильнополярного компонента
(обычно воды) и низкомолекулярного спирта или другого растворителя,
смешивающегося и с водой, и с неполярным копонентом. Поскольку в таких
системах должно установиться динамическое сорбционное равновесие и очень
часто состав смеси почти соответствует пределу насыщения, температуру
необходимо тщательно контролировать. В динамических условиях может быть
достигнута относительно высокая загрузка полярного твердого вещества
жидкой неподвижной фазой вплоть до 0,5 г/г [37]. Заранее предсказать
точный состав жидкой неподвижной фазы и равновесной ей подвижной фазы
трудно. Поэтому изменение состава элюента (или обновление его) может
приводить к изменению удерживания вследствие изменения равновесной
концентрации полярного компонента.
Хроматографическая колонка 41
Одно из преимуществ распределительных систем заключается в том, что на
одной и той же колонке можно проводить разделение с использованием
различных неподвижных фаз. Жидкую фазу удаляют промыванием колонки
неполярным элюеитом, например дихлорметаном. После этого колонка пригодна
