Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
около 3,5-10~5 см2/с). Если эти условия не выполняются, h принимает более
высокое значение. Вторичные механизмы удерживания, например лигандный
обмен, могут вызывать дополнительное размывание пиков.
30 Глава 2
2.2. Механизм удерживания
2.2.1. Введение
Возможность разделения двух соединений обусловлена различием в свободной
энергии их сорбции в хроматографической системе (неподвижная фаза и
элюент). Чем больше это различие, тем легче достигнуть разделения этих
двух соединений и тем меньшее число тарелок для этого необходимо.
Поставщики, как правило, определяют эффективность колонок для элюентов с
низкой вязкостью и соединений с небольшой молекулярной массой, что не
соответствует условиям биохимического применения ВЭЖХ.
В принципе приемы классических методов разделения - жидкостной
хроматографии низкого давления - применимы и в высокоэффективной
хроматографии, если неподвижные фазы идентичны и выдерживают повышенное
давление, а элюент удовлетворяет условиям обнаружения. Использование
химически привитых фаз расширяет возможности ВЭЖХ, делая ее пригодной для
разделения водорастворимых соединений. В настоящее время около 90% всех
анализов методом ВЭЖХ выполняют на химически привитых фазах, главным
образом фазах с привитыми алкильными группами (обращенных фазах). Методы
гель-проникающей хроматографии, осуществляемой на механически непрочных
сорбентах типа сефадекса и др., не применимы в ВЭЖХ. Однако силикагель
можно получать в виде частиц с различным распределением пор по диаметру,
и после соответствующей химической модификации его можно использовать в
высокоэффеткивной гель-эксклюзионной хроматографии высокого разрешения.
Ионообмененное хроматографическое разделение осуществляется на
механически прочных смолах и ионообменниках на основе силикагеля.
Схематическая дифференциация по механизмам сорбции разделяемых веществ
дает только общую картину процесса разделения. Удерживание компонентов
биологических проб может быть обусловлено несколькими механизмами. Однако
взаимодействие между поверхностью неподвижной фазы возможно только в том
случае, если разделяемые соединения способны проникать в поры неподвижной
фазы и имеют доступ к ее поверхности. Для сферических частиц (10 мкм) на
долю внешней, геометрической, поверхности приходится менее 1% их общей
поверхности. Неоднородность поверхности, возможная даже у химически
привитых фаз, оказывает заметное влияние на удерживание, например в
обращенно-фазовой хроматографии оставшиеся немодифицированными
силанольные группы вызывают разделение по ионообменному и ион-
эксклюзионному механизмам. Изменение состава элюента в различной степени
Хроматографическая колонка 31
влияет на разные механизмы разделения, поэтому для получения
воспроизводимых хроматографических результатов необходимы данные о
механизме разделения и их относительной роли, а также о влиянии на них
состава элюента.
Выбирая условия разделения, следует исходить из его цели. Одна из
возможных целей хроматографического разделения- это определение состава
смеси, т. е. разделение и качественная и количественная идентификация
компонентов смеси. В этом случае следует использовать систему с
приемлемым разрешением, хорошей воспроизводимостью и точностью. Если
имеются соответствующие стандарты, оптимизацию системы провести несложно.
В этом случае допустимы даже такие хроматографические условия, которые
приводят к деструкции разделяемых соединений. Вторая цель
хроматографического разделения - препаративное разделение, оптимизировать
условия которого более сложно, особенно с учетом того, что в процессе
разделения необходимо сохранить биологическую активность разделяемых
соединений. Наложение различных механизмов разделения часто приводит к
плохому разделению компонентов смеси и плохому их выходу. Сорбционные
процессы могут иногда вызывать изменения структуры разделяемых веществ,
поэтому для препаративного разделения предпочтительна гель-эксклюзионная
хроматография. Однако, чтобы выход разделяемых соединений был высоким,
возможность вторичных взаимодействий следует свести до минимума.
2.2.2. Характеристики силикагеля
В классической колоночной жидкостной хроматографии в качестве неподвижных
фаз широкое распространение получили оксид алюминия и силикагель. С
появлением ВЭЖХ силикагель стал основной неподвижной фазой; в этом виде
хроматографии он применяется и как таковой, и как носитель химически
привитых фаз. На рис. 2.3 показаны возможные варианты использования
силикагеля. При обсуждении механизма удерживания на неподвижных фазах с
химически привитыми функциональными группами в первую очередь принимают
во внимание свойства именно этих групп, однако не учитывать свойства
силикагеля-носителя было бы ошибкой. Поэтому в данном разделе свойства
силикагеля будут обсуждены прежде, чем отдельные методики разделения.
Выпускаемые промышленным способом силикагели различаются по своим
