Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
В результате можно добиться получения более узких хроматографических зон
разделяемых соединений или, иными словами, более эффективного разделения
и симметричных пиков, как при элюировании нейтральных соединений. В то же
время в элюент целесообразно добавлять органические кислоты или
основания, которые играют роль "противоионов", взаимодействующих с
разделяемыми веществами. В таких системах всегда должна присутствовать
"органическая" фаза - как элюент или как не-
58 Глава 2
подвижная фаза. Другими словами, необходимо образование способных
диссоциировать "ионных пар", экстрагируемых "органической" фазой.
Образование иоиных пар существенно влияет на удерживание ионогенных
компонентов пробы, но не влияет на удерживание неионогенных компонентов.
В результате возникает дополнительная возможность оптимизации условий
разделения веществ, а также идентификации ионогенных компонентов сложных
смесей при помощи так называемого "метода сдвига пиков".
В основу ион-парной хроматографии (ИПХ) положены принципы классической
экстракции из водной в органическую-фазу ионных веществ в виде ион-парных
соединений [67]. Эти принципы были перенесены в хроматографию, причем в
зависимости от типа используемых фаз метод разделения получил разные
названия. Синонимы ИПХ - экстракционная хроматография, жидкостная
ионообменная хроматография, пар-ионная хроматография (ПИХ) и детергентная
хроматография [66,68]. Последние два названия предпочтительны, если в
качестве неподвижной применяют обращенную фазу.
Вначале разделение по методу ион-парной ВЭЖХ проводилось на колонках,
заполненных силикагелем, на поверхность которого были нанесены из водного
раствора буфер и соль для формирования ионных пар. В рассматриваемом
примере солью служил нафталинсульфонат натрия, а элюентом - хлороформ.
Указанная хроматографическая система применялась для разделения
алифатических аминов или дипептидов. Разделяемые соединения образовывали
ионные пары в результате взаимодействия аминогрупп с нафталинсульфонатом
и в виде ионных пар экстрагировались в подвижную фазу. Ионные пары, в
состав которых входили соединения алифатического ряда, обнаруживали УФ-
детектором [69].
Наиболее широкое распространение в ИПХ получили обращенные фазы,
поскольку добиться установления равновесия в колонке, предварительно
заполненной силикагелем, при пропускании через нее водных растворов солей
или путем изменения нанесенной фазы достаточно сложно. В ИПХ существуют
широкие возможности для оптимизации условия разделения, поскольку
допускается изменение pH, концентрации и вида противоионов в составе
элюента. Для разделения можно использовать водные растворы проб, поэтому
ИПХ широко применяют для разделения биохимических объектов.
Механизм разделения методов ион-парной хроматографии можно пояснить на
двух экстремальных примерах. В водных элюентах противоионы и ионы
разделяемых соединений образуют диссоциирующие ионные пары (в подвижной
фазе), которые селективно удерживаются на неподвижной фазе и в результате
разделяются. Если противоионы адсорбируются на непод-
Хроматографическая колонка 59
вижнон фазе, ионы разделяемых соединений взаимодействуют с ними,
удерживаются и соответственно разделяются. В зависимости от природы
противоиона, его гидрофобности, содержания органического компонента в
элюенте, гидрофобной или гидрофильной природы компонентов проб доминирует
тот или другой механизм разделения.
В простейшем случае, когда органическая кислота сорбируется в виде
ионной пары с тетрабутиламмониевым ионом, ионы находятся в элюенте, а
ионные пары сорбируются на неподвижной фазе [8].
(RCOO-)b№i+(TBA+)bowWRCOO-TBA+)opp (8)
Процесс сорбции можно описать при помощи константы равновесия Е:
? - (RCOO ТБА+]0рг /д\
- [RCOO-J,^ [ТБА+1В0ДИ
Экстракционное равновесие зависит от pH элюента, ионной силы,
температуры, свойств органического компонента элюента и вида противоиона.
Коэффициент емкости k разделяемых соединений пропорционален константе
равновесия и концентрации противоионов в водной подвижной фазе:
?~?[ТБА+]В0Д" (10)
Ситуация осложняется тем, что на удерживание оказывают влияние и другие
ионы, вводимые вместе с противоионом или находящиеся в пробе, ионная сила
элюента, вид буфера, органический компонент элюента и температура.
Варьирование этих параметров позволяет проводить оптимизацию условий
разделения. Далее мы обсудим некоторые важнейшие принципы ИПХ.
Тип противоиона. Как отмечалось выше, коэффициент емкости
увеличивается пропорционально концентрации противоиона (рис. 2.18). При
разделении длинноцепочечных алкилсульфатов k может уменьшаться при
значительном увеличении их концентрации в пробе. С увеличением
концентрации децилсульфата k сначала растет, а затем уменьшается [51],
что объясняют насыщением неподвижной фазы алкилсульфатом, придающим ей
