Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
селективности). Принципы ион-парной хроматографии рассмотрены в разд.
2.2.5.
В условиях обращенно-фазовой хроматографии возможны затруднения при
определении мертвого времени колонки tM [2, 64, 129]. Точное значение tAг
необходимо для определения свободного объема колонки, объемной скорости
элюента, а также параметров удерживания k и а. Обычно tM определяют по
времени выхода элюента, вводимого в колонку
вместе с анализируемой пробой. В этих целях можно использовать
дейтерированный элюент, но для его обнаружения необходим дифференциальный
рефрактометр. Водно-органические элюенты дают иногда не один, а два пика.
В этом случае, используя смесь органического компонента с D2O в
идентичной концентрации можно получить один пик, характеризующий tM.
Применение УФ-детекторов для определения ограничено недостаточной
чистотой органических растворителей, используемых в составе элюентов, в
которых роль инертного растворен-
Без ТЗА
• t, мин
Рис. 2.16. Влияние силанольных групп
на удерживание и их маскирование три-этиламином (ТЭА).
Неподвижная фаза: лихросорб Si 100, Cia, обработанный
гексаметилдиснлазаном; элюент: метанол/вода (0,0i М КН2РО4) (2/8 по
объему) с добавками ТЭА; проба: прокаинамид, N-аце-тилпрокаинамнд.
56 Глава 2
ного соединения может играть нитрометан. Мертвое время, определенное в
органических элюентах, можно применить и для расчетов при разделении в
водном элюенте, так как у неподвижных фаз на основе силикагеля ни
пористость, ни плотность упаковки при переходе от органических элюентов к
воде и наоборот не меняются. В табл. 2.2 (см. разд. 2.1.3) суммированы
некоторые предположения, касающиеся определения tM-Отметим в заключение,
что определение tM при помощи окрашенных анионов или катионов
неприемлемо, так как велика вероятность их специфического ионного
взаимодействия с сила-нольными группами.
2.2.4.3. Влияние на удерживание структуры разделяемых соединений.
Влияние структуры разделяемых соединений на время их удерживания в
обращенно-фазовой хроматографии проследить легче, чем при разделении на
немодифицированном силикагеле. В первом приближении можно принять, что
время удерживания возрастает с уменьшением растворимости соединений в
воде, т. е. с уменьшением их полярности. В гомологических рядах
прибавление каждой метиленовой группы увеличивает время удерживания
(энергия сорбции возрастает при этом примерно на 600 Дж/моль). Время
удерживания органических соединений, имеющих разветвленные алкильные
группы, меньше, чем линейных соединений с такой же молекулярной массой,
причем чем больше степень разветвления, тем меньше время удерживания.
Насыщенные углеводороды элюируются раньше, чем ненасыщенные. Влияние
наличия функциональных групп на время удерживания иллюстрирует рис. 2.17.
Если элюирование осуществляют водой, то наличие двух метильных групп в
качестве заместителей оказывает такое же влияние на время удерживания,
как одна этильная группа. Такой же эффект отмечен для хлорфенолов.
Наличие одной нитрогруппы увеличивает k, однако вторая и третья
нитрогруппы значительно уменьшают k (пикриновая кислота и динитрофенол
хорошо растворимы в воде). Такой же эффект характерен также для
гидроксифенолов.
Приведенные выше правила справедливы и для удерживания стероидов и
органических соединений других классов. Гидро-ксистероиды элюируются
перед стероидами с карбонильными группами, находящимися в том же
положении. Ацетилирование гидроксильных групп увеличивает время
удерживания стероидов.
Наличие ионогенных групп обычно не влияет на удерживание. Этот факт
используют для изменения порядка элюирования, например дипептидов, путем
изменения pH элюента. Так, при высоком pH Trp-GlyO- элюируется после Gly-
TrpO-, так как ионизирующаяся часть молекулы в большой степени сольвати-
Хроматографическая колонка 57
+ N0, 41 12
ОН
+ СН, + 2СН, + ЗСН;
+ ОН0.4)
+ 2 ОН
+20Н +0Н
V.V* И
-I
О
Рис. 2.17. Влияние структуры разделяемых соединений иа время удерживания
производных феиола [2].
Неподвижная фаза: обращенная фаза Си; элюент; вода.
рована и поэтому не взаимодействует с гидрофобной неподвижной фазой. При
низких значениях pH часть пептида с протони-рованным амином
сольватирована в большой степени, и поэтому H+Gly-TrpOH элюируется после
H+Try-GlyOH. При pH, соответствующем изоэлектрической точке, разделить
цвиттер-ионы не удается [65].
Детальное обсуждение природы гидрофобных или органо-фобиых
взаимодействий и теоретические основы процесса приведены в работах [4,
66].
2.2.5. Вторичные равновесия в обращенно-фазовой хроматографии
2.2.5.1. Ион-парная хроматография. Условия разделения соединений,
диссоциирующих в водном растворе, можно, как и в бумажной или
тонкослойной хроматографии, оптимизировать путем такого изменения pH
элюента или неподвижной фазы, которое приведет к подавлению диссоциации.
