Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
mitt В2, rfb-2, gyrA25, ihyA142, oms-2, metC65, oms-t, {tte-1), A(bioH-asd)29, cycB2,
hs’dR2.
142
Глава 6
МС1061 [17] очень хорошо подходит и довольно широко используется для трансформации «простыми» методами с применением СаСЬ. Этот штамм, однако, не поддается эффективной трансформации теми методами, которые подразумевают применение диметилсульфоксида (ДМСО), и может быть рекомендован только для кальциевой трансформации.
При работе с рекомбинантными ДНК удобно использовать производные полученного Хоффманом Берлингом штамма 1100 [18]. Они эффективно трансформируются всеми описанными ниже методами. Штаммы хорошо растут и дают превосходный выход плазмидной ДНК. Дефектность по эндонуклеазе А увеличивает выход и улучшает качество плазмидной ДНК при получении ее в аналитических количествах. Рекомендуемые производные штамма 1100 — это ММ294 [18], DH1 [15] и JM109 (Дж. Мессинг, личное сообщение). JM109 —новый гесЛ~-хозяин для фага М13, полученный из DH1. Он дефектен по К-системе рестрикции, не является лизогенным и потому больше всего подходит на роль хозяина при клонировании в М13 (Дж. Мессинг, личное сообщение). Штамм DH1 несет мутацию recAl. Этот штамм хорошо использовать в качестве хозяина при работе с рекомбинантными ДНК, для «спасения» интегрированных плазмид и для клонирования больших фрагментов ДНК-
Недавно выделен производный от DH1 штамм DH5. Этот штамм трансформируется приведенными здесь методами значительно лучше, чем DH1. Эффективность его трансформации при использовании простой методики достигает 2• 107 трансформан-тов/мкг ДНК pBR322 и 4—12-108 трансформантов/мкг для стандартного высокоэффективного метода. Бактерии DH5 можно трансформировать большими (40—60 т. п. н.) плазмидами в 10— 20 раз эффективнее, чем DH1. Этот штамм характеризуется низкой частотой рекомбинации и мутагенеза.
Многие из упоминающихся здесь бактериальных штаммов хранятся в коллекции культур (Е. coli Genetic Stock Center).
3. Хранение штаммов Е. coli
Е. coli — очень удобный объект генетических исследований, условия его культивирования и хранения могут быть самыми различными. Однако эффективность трансформации во многом определяется именно этими факторами. Три метода хранения Е. coli дают надежные результаты при получении компетентных клеток.
1. Замораживание клеток при —70 °С или в жидком азоте.
2. Медленный анаэробный рост в столбиках агара.
3. Аэробный рост на чашках с агаром при комнатной температуре.
\
Методы трансформации Е. coli
143
Сроки хранения Е. coli этими методами составляют соответственно 10—20 лет, 1—2 года и несколько дней. Хранение клеток Е. coli в 50%-ном глицерине при —20°С и на чашках или в столбиках при 4 °С, как правило, не рекомендуется.
Три основных способа хранения описаны ниже. В каждом случае клетки следует рассеять штрихом на чашке с агаром и проинкубировать до появления колоний. Затем при помощи стерилизованной в пламени вольфрамовой петли собирается несколько отдельных колоний.
3.1. Замороженные клетки
Отберите несколько свежих колоний и засейте в 5 мл богатой среды, например SOB (см. табл. 6.12). Инкубируйте на качалке до тех пор, пока культура не достигнет среднепоздней логарифмической фазы роста (1—2-108 клеток/мл). Разбавьте культуру вдвое раствором, содержащим 60% среды и 40% глицерина, разлейте по 1 мл в 2 мл полипропиленовые пробирки с завинчивающейся крышкой (или подобные), охладите во льду, быстро заморозьте в жидком азоте и храните при —70 °С. Для восстановления культуры выньте пробирку из холодильника, быстро соскребите немного замороженных клеток с поверхности замерзшей культуры и положите пробирку обратно в холодильник. Не допускайте значительного нагрева и оттаивания содержимого пробирки. Перенесите замерзший кусочек культуры с клетками на поверхность чашки с агаром. После того как он растает, разотрите каплю и проинкубируйте чашку до появления отдельных колоний. Обычно готовят серию из нескольких пробирок с замороженными клетками. Одной пробиркой пользуются 10— 30 раз, затем ее выбрасывают и переходят к следующей. (Титр жизнеспособных клеток падает при многократном отборе клеток из пробирки. Если при восстановлении культуры вырастает лишь несколько колоний, пробирку следует сменить.)
3.2. Столбики агара
Приготовьте среду для культивирования, например SOB, содержащую 0,8% бакто-агара. Проавтоклавируйте или поместите ненадолго в микроволновую печь для расплавления агара и разлейте по 4 мл в плотно закрывающиеся стеклянные флаконы объемом 5 мл (флаконы Bijou или сходные). Проавтоклавируйте и оставьте неплотно закрытыми на ночь для удаления сконденсировавшейся влаги. С помощью стерилизованной в пламени вольфрамовой петли отберите несколько свежих индивидуальных колоний. Обожгите крышку флакона, снимите ее, быстро погрузите петлю в толщу агара и плотно закройте крышку. Храните столбики в темноте при комнатной температуре (не при 4 °С).
144
Глава 6
I
