Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
I
3.3. Хранение на чашках при комнатной температуре
Нанесите клетки штрихом на чашку с агаром и проинкубируйте при 37 °С до появления колоний диаметром 1—2 мм. Храните при комнатной температуре. Если для засева жидкой культуры или пересева на другую чашку используются старые, крупные колонии, отбирать клетки лучше с их края, там, где они продолжают расти.
4. Методики трансформации
4.1. Простая методика
Методика, предложенная Манделем и Хигой, до сих пор остается в основном неизменной — отчасти благодаря ее простоте и применимости для широкого спектра штаммов Е. coli. Если какой-либо штамм трансформируется плохо, эту методику можно видоизменить. Во-первых, выращивайте клетки в среде, содержащей 10—20 мМ MgCh, — условие, крайне важное для описанных ниже сложных методик трансформации, но не всегда полезное для данной методики. Например, добавление Mg2+ к среде способствует трансформации клеток DH1, но уменьшает частоту трансформации MCI061. По-видимому, это объясняется различиями в составе их клеточной оболочки. Вторая возможная модификация состоит в использовании для трансформации буферов TFB или SB2 (содержащих МпСЬ и СаСЬ, ,см. табл. 10). Любой из этих буферов может увеличить эффективность трансформации штаммов, плохо трансформирующихся по простой методике. Таким образом, один-два дня дополнительной работы па сравнению буферов могут значительно улучшить результаты трансформации штамма, который подходит вам по генетическим признакам, но плохо трансформируется плазмидами.
Методика, описанная в табл. 2, проста, но применение ее несколько ограничено. В частности, ее эффективность, обычно вьь
Таблица 2. Простая методика трансформации
]. С помощью простерилизованной в пламени вольфрамовой петли отберите с чашки несколько свежих колоний диаметром 2—3 мм и диспергируйте клетки на встряхивателе в 1 мл среды1*. При отборе колоний старайтесь не захватывать кусочков агара.
2. Засейте диспергированными клетками колбу Эрленмейера с культуральной средой. Обычно одной колонией засевают 10 мл среды. Объем среды должен составлять менее 10% объема колбы. Рекомендуется среда SOB2> (с добавлением или без добавления Mg2+ в зависимости от штамма).
3. Инкубируйте культуру при 37 °С с умеренным встряхиванием3) до тех пор, пока она не достигнет середины логарифмической фазы роста и не будет содержать 4-9-107 жизнеспособных клеток/мл.
4. Перенесите культуру в центрифужные пробирки (типа Falcon 2070-или подобные) и охладите во льду 10—60 мин.
Методы трансформации Е. coli
145
Продолжение-
5. Осадите клетки центрифугированием при 750—1000 g (~2000— 3000 об/мин в стандартной центрифуге) 15 мин при 4°С. Слейте надосадок и поставьте пробирки ненадолго вверх дном на бумажное полотенце, при необходимости слегка постучав по ним для удаления остатков жидкости.
6. Ресуспенднруйте клетки в простом буфере для трансформации (SB)5> (в объеме, равном 1/3 исходного объема культуры) или в стандартном буфере TFB6) либо на встряхивателе при небольшой скорости, либо набирая к выпуская суспензию из пипетки. Проинкубируйте во льду 10—60 мин.
7. Осадите клеткн центрифугированием 15 мин при 750—1000 g. Тщательно удалите надосадок (см. стадию 5).
8. Суспендируйте клетки в SB или TFB в 1/12,5 исходного объема культуры или его части, соответствующей каждой из центрифужных пробирок. Таким образом, 2,5 мл культуры концентрируются в 200 мкл SB. Именна такой объем клеток является стандартным для трансформации.
9. Разлейте клетки по 200 мкл в стеклянные или полипропиленовые пробирки размером 17ХЮ0 мм нли 12X60 мм.
10. Добавьте раствор ДНК в объеме <200 мкл. Для равномерного перемешивания ДНК и клеток пробирку вращают между ладонями. Проинкубируйте во льду 10—60 мин.
11. Поместите пробирки на 90 с в водяную баню с температурой 42 °С (тепловой шок), затем охладите, быстро перенеся в лед (0°С).
12. Добавьте 800 мкл среды и проинкубируйте при 37 °С с умеренным-встряхиванием 30—60 мин6>. Рекомендуется среда SOB2).
') При трансформации клеток МС1061 жидкая и твердая среды ие должны содержать Mg^. Для клеток DH1 и C60Q добавьте в среду 20 м№ M.g2+. Подробности — вь тексте.
2) См. табл. 12.
3) Умеренное встряхивание достигается на роторном встряхивателе с амплитудой, 1—2 см при скорости 250 об/мин илн в эквивалентных условиях.
4) 4—9• 107 клеток/мл соответствуют для штаммов гес~ 0п55о=0,35—0,6, а для штаммов гес+ ОП55о=0,2—0,4.
5) См. табл. 10.
6) При трансфекции ДНК М13 эта стадия не нужна.
ражающаяся числом колоний, образующихся на 1 мкг ДНК pBR322, невысока (от 105 до 107), так же, как и доля компетентных клеток (обычно 10~3—10~6). Последняя цифра определяет число колоний, которые в принципе могут быть образованы препаратом компетентных клеток (колониеобразующий потенциал). Это проявляется в форме кривой насыщения, когда все меньшее число дополнительных колоний образуется при добавлении возрастающих количеств ДНК. Как правило, к препарату клеток добавляется менее 10 нг трансформирующей плазмидной ДНК. Эта цифра, естественно, отличается от истинного количества ДНК плазмиды, присутствующего после отжига и лигирования, так как значительная часть плазмидной ДНК может находиться в нетрансформирующей (например, линейной) форме.
