Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
135
pEMBL Yi 22 PEMBL Yl 21 (обратная ориентация')
PEMBL Ye 23 PEMBL Ye 24 (обратная ориентация')
pEMBL Yr25
pEMBL Yi 27
PEMBL Ye 30
Рис. 2. Схема, представляющая физические и генетические карты плазмид pEMBL. Позиции рестрикционных сайтов определены на основании нуклеотидных последовательностей pEMBL9 [5], URA3 [11], TRPI [12] и 2мкм-плазми-ды [13]. Прямого анализа последовательности не проводилось.Мы считаем, что после различных ферментативных обработок перестроек и делеций на границах между фрагментами ДНК не происходило. Уникальные сайты рестрикции в кодирующей последовательности а-пептида были проверены при помощи расщепления рестриктазами соответствующих плазмид и анализа продуктов электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Сокращенные обозначения рестриктаз: E = ?coRI, N = iVcoI, EV=?coRV, St=S^«I, Hp = #pal, M=Afs?I, Bg=Bg/II, X=Xhol, K=/Cpnl, Bst = BstU, N=iVarI. Стрелками показаны направления транскрипции и репликации.
было бы с высокой точностью делетировать ненужные последовательности в процессе отжига одноцепочечного вектора со специфическим олигонуклеотидом, репарации in vitro и разделения мутантной и дикой форм в потомстве фага. Методика мутагенеза in vitro описана в гл. 8 этой книги. Этот метод не требует внесения случайных делеций при помощи ферментов и трудоемкого отбора клонов на основе анализа их нуклеотидной последовательности. Если имеется конструкция, обусловливающая сверхпродукцию нужного белка, то направляемый олигонуклеотидом мутагенез можно провести прямо на ней. Полученную плазмиду,
Av^Sm SyfolEV,P
Сайты клонирования BamHl EcoRI Hind Ш Sail
Другие уникальные сайты: Apal NC01 EcoRV
AvSm Stftp^P ESt V Hp Ay
E X b±
trpl
Av\HpBstCK ЕЕУ 1 Ieu2
Av Hp P
\
Ыа
EVE КС BstHo/Av —i_<-------i.t i, IIJ
BamHl Apal ,
Hind III Ncol
Sail EcoRV
Aval EcoRV
BamHl Bgill
Sail MStI
Smal StuI
ХЬаГ
BamHl BstEU
Hind III Clal
Pstl EcoRV
Sal I Kpnl
Smal Narl
BamHl BstEU
Hlndlll ciai
Smal ECOBV
Kpnl
Fforl
Naf I
bU
ATG tag Z—
W" Ct B57
|' IGATCCGTCGACCTGCA6CCATTG
Aval EcoRi i-----------1 i------1
Ecow SaU Hind
pEMBL ex2
Sail Hind III
I Clal|_
Ecori Hind III
BamHI Sal I Pstl
pEMBL ex3
Рис. 3. Физические карты экспрессирующих векторов pEMBLex2 и рЕМВЬехЗ.
О нуклеотидной последовательности полилинкера этих векторов судили по последовательности образовавших его фрагментов, с учетом проводившихся при клонировании ферментативных обработок. RBS — участки связывания рибосом гена репликазы MS2 и гена Ксго.
несущую мутантную кодирующую последовательность, можно сразу использовать для наработки в Е. coli больших количеств продукта измененного гена.
Наши плазмиды сконструированы на основе двух плазмид, которые содержат промотор Рь или Pr фага К. Эти промоторы обеспечивают транскрипцию в направлении последовательностей, включающих участок связывания с рибосомой и инициирующий AUG-кодон генов репликазы фага MS2 [9], или сго-белка фага X [10]. Эти фрагменты были вставлены в полилин-кер плазмиды pEMBL8 таким образом, что для определения последовательности от кодона AUG и далее могла быть использована универсальная затравка, комплементарная участку связывания с рибосомой (рис. 3). Инициирующий кодон AUG расположен в одной трансляционной рамке с последовательностью, кодирующей а-пептид [i-галактозидазы, что позволяет проводить скрининг рекомбинантов по цветной реакции на чашках, содержащих X-Gal. Удобные для клонирования уникальные рестрикционные сайты находятся сразу за инициирующим кодоном.
4. Методика получения одноцепочечной ДНК pEMBL
Процедура получения препарата фага fl для суперинфекции бактерий, несущих плазмиды pEMBL, описана в табл. 1. Методика суперинфекции клеток и выделения одноцепочечной ДНК приведена в табл. 2. Полученная таким образом ДНК пригодна для определения нуклеотидной последовательности. Выход одноцепочечной ДНК из 1 мл культуры составляет около 0,5 мкг.
Семейство одноцепочечных векторов pEMBL
137
Таблица 1. Получение препарата фага !1
1. Внесите в 1 мл Ь-бульона!> содержимое отдельной бляшки фага fl2>
и инкубируйте 3 часа при 37 °С.
2. Разбавьте культуру 200 мл L-бульона.
3. Продолжайте инкубацию при 37 °С в течение ночи.
4. Осадите клетки центрифугированием и соберите надосадок, содержащий секретированный клетками фаг.
5. Определите титр фага в надосадке при помощи серийных разведений L-бульоном. Аликвоты разведений объемом 0,1 мл смешайте с 0,2 мл стационарной культуры Е. coli 71/183). Добавьте 3 мл расплавленного и хранившегося при 45 °С верхнего слоя и вылейте на чашку с Ь-агаром4). Количество бляшек подсчитайте через 8 ч инкубации при 37 °С. Надосадок можно хранить 1—2 месяца при 4 С, а длительное время — заморозив аликвоты прн —20 °С.
