Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
4.2. Методика стандартной высокоэффективной трансформации
«Стандартная» процедура трансформации, описанная в табл. 3, является итогом систематического исследования факторов, влияющих на трансформацию Е. coll плазмидами [15]. Ос-
10—196
146
Глава 6
Таблица 3. Стандартная методика трансформации
1. Отберите несколько свежих колоний диаметром 2—3 мм, выращенных на чашках с агаром SOB1), и суспендируйте их на встряхивателе в 1 мл среды SOB. Засейте 1 колонией 10 мл среды. Для того чтобы получить свежие колонии, лучше всего рассеять клетки на чашке штрихом из замороженного образца или свежего столбика агара за 16—20 ч до приготовления жидкой культуры.
2. Засейте клетками колбу Эрленмейера со средой SOB. Отношение объема культуры к объему колбы должно составлять от 1:10 до 1 :30 (т. е. 30—100 мл на колбу объемом 1 л).
3. Проинкубируйте с умеренным встряхиванием2) при 37 °С до тех пор, пока титр культуры не достигнет 4—7 • 107 жизнеспособных клеток/мл3).
4. Перенесите культуру в полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 50' мл (например, пробирки Falcon 2070) и охладите во льду 10—15 мин.
5. Осадите клетки центрифугированием при 750—1000 g (2000— 3000 об/мин) в течение 12—15 мин при 4°С. Тщательно удалите остатки жидкости, постучав перевернутой пробиркой по бумажному полотенцу. Оставшиеся капли можно удалить микропипеткой.
6. Суспендируйте клетки в буфере TFB4> (*/з исходного объема культуры) на встряхивателе при небольшой скорости. Проинкубируйте 10—15 мин во -льду.
7. Осадите клетки и удалите надосадок так же, как на стадии 5.
8. Ресуспендируйте клетки в TFB (1/12,5 исходного объема культуры). При этом 2,5 мл исходной культуры сконцентрируются до 200 мкл.
9. Добавьте раствор ДМСО и ДТТ (ДиД)4> до 3,5 об. %, то есть 7 мкл на 200 мкл суспензии клеток. ДиД добавьте в толщу суспензии и сразу .размешайте, вращая пробирку между ладонями в течение нескольких секунд. Проинкубируйте 10 мин во льду.
10. Добавьте вторую порцию раствора ДМСО и ДТТ (ДиД) так же, как на стадии 9. Концентрация ДиД составит 7%. Проинкубируйте пробирки во льду 10—20 мин.
11. Разлейте пипеткой аликвоты по 210 мкл в охлажденные на льду полипропиленовые пробирки размером 17X100 мм (Falcon 2059 или подобные) .
12. Добавьте раствор ДНК в объеме <20 мкл и смешайте, вращая пробирку между ладонями. Проинкубируйте пробирки во льду 20—40 мин.
13. Поместите пробирки на 90 с в водяную баню с температурой 42 °С (тепловой шок). Для остановки теплового шока перенесите пробирки в лед И охладите 2 мин.
14. Добавьте в каждую пробирку 800 мкл среды SOC1). Проинкубируйте с умеренным встряхиванием 30—60 мин при 37 °С5).
15. Рассейте клетки на чашках с агаром, содержащим нужные для селекции трансформантов добавки.
Варианты:
1. ДМСО и ДТТ можно добавлять по отдельности. В этом случае поступите следующим образом:
9а. Добавьте ДМСО до концентрации 3,5% (по объему) (т. е. 7 мкл на на 200 мкл суспензии клеток. ДиД добавьте в толщу суспензии и сразу размешайте, вращая пробирку между ладонями в течение нескольких секунд. Проинкубируйте 10 мин во льду.
96. Добавьте раствор ДТТ до 3,5% (по объему) (т. е. 7 мкл 2,2 М ДТТ, 10 мМ ацетата калия pH 6,2 на 200 мкл суспензии клеток) и размешайте 5 с. Проинкубируйте 10 мин во льду.
10. Добавьте вторую аликвоту ДМСО. Конечная концентрация составит 7%. Проинкубируйте 5—10 мин во льду.
Методы трансформации Е. coli 147
Продолжение
2. Раствор ДМСО+ДТТ можно добавлять одной аликвотой, т. е. ср азу-до 7% (по объему) (14 мкл на каждые 200 мкл смеси для трансформации). Эффективность трансформации составит 75% от получаемой при двукратном добавлении.
J) См. табл. 12.
2) См. примечание 3 к табл. 2.
3) Для клеток DH1 это соответствует ОПвБо^СМб—0,55.
4) См. табл. 10.
5) При трансфекции М13 эта стадия не нужна.
новное преимущество этого метода — очень высокая эффективность трансформации и для крупных, и для релаксированных плазмид; высока в данном случае и доля компетентных клеток. При получении компетентных клеток таким способом необходимо постоянное внимание к деталям. На эффективность метода влияют различные примеси в препаратах используемых реагентов. Если тщательно готовить растворы и использовать реактивы необходимого качества, с помощью этого метода всегда можно получить необходимую для многих целей высокоэффективную трансформацию. Эффективность трансфекции репликативной формой ДНК бактериофага М13 сравнима с эффективностью-трансформации-плазмидами сходного размера, поэтому методика может применяться и для введения векторов М13 в хозяйские клетки.
Приведенная в табл. 3 методика содержит в сравнении с оригиналом [15] единственную модификацию: применен раствор, содержащий одновременно ДМСО и дитиотрейтол (ДТТ), так что вместо трех раз реагенты добавляются в смесь дважды. При этом эффективность трансформации штамма Е. coli DH1 и родственных штаммов такая же или выше, чем при раздельном: внесении этих реагентов. Более того, смесь ДМСО + ДТТ можно вносить одной аликвотой, при этом частота трансформации составит 75% от частоты, которая достигается при двух добавлениях. В конце таблицы кратко описана и оригинальная методика.
