Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
‘) Состав L-бульона: бакто-триптон—10 г; дрожжевой экстракт — 5 г; NaCl—10 г; Н20 —до 1 л; pH доводят до 7,5 NaOH.
2) Мы используем штамм IRX [3].
3) Генотип Е. coli 71/18 A[lac~pro]F' laclЧ lacZ ДЛП5 pro+ supB,
4) L-агар содержит 15 г бакто-агара на 1 л L-бульона; верхний слой —7 г бакто-агара на 1 л L-бульона.
Таблица 2. Получение одноцепочечной ДНК-матрицы
1. Внесите в 1 мл L-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, свежую колонию бактериальных клеток, несущих плазмиду pEMBL, и инкубируйте до насыщения при 37 °С.
2. Разбавьте культуру в 50 раз L-бульоном и растите до ОПвбо=0,2.
3. Инфицируйте клетки препаратом фага fl (IR1), приготовленным согласно табл. 1, при множественности инфекции 20 бляшкообразующих единиц (б. о. е.) на клетку1*. Продолжайте культивировать клетки при 37 °С в течение 6 ч.
4. Отцентрифугируйте 1 мл культуры в течение 5 мин в микроцентрифуге.
5. Осторожно (чтобы не взболтать осадок) отберите 800 мкл надоса-дочной жидкости.
6. Добавьте к надосадку 200 мкл 2,5 М NaCl, 20% полиэтиленглнколя (ПЭГ) 6000 и проинкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Отцентрн-фугируйте 5 мин в микроцентрифуге.
7. Очень осторожно удалите надосадок, осадок растворите в 100 мкл 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 1 мМ ЭДТА. Экстрагируйте белки, осторожно встряхивая раствор со 100 мкл фенола, насыщенного 0,1 М трис-НС1 pH 9,0; 10 мМ ЭДТА.
8. Отцентрифугируйте 1 мин для разделения фаз. Осторожно отберите водную фазу ( — 80 мкл), добавьте к ней 50 мкл изопропанола и 20 мкл
5 М перхлората натрия.
9. Осадите нуклеиновые кислоты центрифугированием в течение 15 мин. Удалите надосадок и растворите осадок (почти невидимый) в 100 мкл 0,3 М ацетата натрия. Для переосаждения нуклеиновых кислот добавьте 300 мкл этанола.
10. Отцентрифугируйте 15 мин. Осторожно удалите надосадок н ресус-пендируйте осадок в 30 мкл 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 0,1 мМ ЭДТА.
О При ОПв«о=0,2 культура содержит примерно 2-10“ клеток/мл.
размер
вставии(т.п.н)
F1
Рис. 4. Электрофорез в 1%-ном агарозном геле одноцепочечной ДНК- Можно оценить относительную эффективность упаковки рекомбинантных плазмид pEMBL, содержащих вставки различного размера.
Время
инкубации (час) • МИ
3 и I', (,
10^20 10^20 Ю 20 20
ШЩшт
Хромосомная
ДНК
Одноцепочечшя ДНК fl Одноцепочечная ДНК pEMBLj
Рис. 5. Продукция одноцепочечной ДНК при различных условиях. Клетки Е. coli 71/18, несущие плазмиду pEMBL8, выращивали до ОП66о = 0,2 и заражали фагом fl IR1 при множественности инфекции (МИ) 10 или 20 б.о.е. на клетку. После инкубации при 37 °С в течение указанного периода одноцепочечную ДНК выделяли описанным в табл. 2 методом и анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Дорожка 6 содержит ДНК, приготовленную из клеток, инфицированных при ОП660 = 0,4 и МИ 20 б.о.е. на клетку.
Семейство одноцепочечных векторов pEMBL
139
Общий выход ДНК и соотношение ДНК f 1/плазмидная ДНК могут изменяться в 2—3 раза, однако нам не удалось установить причины этих колебаний. В небольшом числе случаев колонии бактерий, содержащих плазмиды типа pEMBL, вообще не продуцировали одноцепочечной плазмидной ДНК. Мы предполагаем, что причина этого заключена в каких-то индивидуальных различиях между колониями, поскольку одноцепочечную ДНК в таких случаях все-таки можно получить, если проанализировать большее число колоний или заново трансформировать бактерии плазмидой. Эффективность синтеза и секреции одноцепочечной ДНК зависит от количества двухцепочечной ДНК, присутствующей в клетках в момент суперинфекции фагом fL В некоторых случаях вставка чужеродной ДНК мешает репликации плазмиды, что приводит к уменьшению числа ее копий, Такие рекомбинанты продуцируют значительно меньше одноцепочечной ДНК, чем ДНК Н, и именно такими свойствами обладают описанные здесь экспрессирующие векторы. Мы заметили также, что эффективность упаковки содержащих сильные промоторы плазмид обратно пропорциональна активности этих промоторов. Одноцепочечную ДНК векторов pEMBLexl и pEMBLex2 можно получить только тогда, когда Я-промотор полностью репрессирован эндогенным геном cl. Эффективность упаковки мало зависит от размера плазмид (см. рис. 4). Изменение в широких пределах как множественности инфекции, так и концентрации клеток в момент инфекции, по-видимому, не отражается на эффективности упаковки (рис. 5). При длительной инкубации при 37 °С после инфекции f 1, однако, одноцепочечная ДНК оказывается загрязненной хромосомной ДНК. Вероятно, это обусловлено массовой гибелью клеток на поздней стационарной фазе.
Благодарности Мы благодарим И. Беннер за перепечатку рукописи.
