Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 53

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 47 48 49 50 51 52 < 53 > 54 55 56 57 58 59 .. 253 >> Следующая

Половина образовавшихся клонов содержит вставку в неправильной ориентации. Из клонов, содержащих вставку в нужной ориентации, только у !/з будет соблюдаться фаза по 5'-концу и лишь »/з из этих последних сохранит фазу и по 3'-концу. В предыдущих экспериментах мы наблюдали, что часто-
Иммунологический метод выявления химерных [5-галактозидаз
.121
Геномная ДНК
EcoRI
1. Расщепление PstI
2. Присоединение dG
-GGG ¦ с(с С -
ССС
gigg-
Присоединение dC
-6G -
Lcjcc-
clcc
[GjGG-
Рис. 2. Клонирование геномной ДНК в Psn-сайте плазмиды pUK270 после присоединения dG/dC-концов. Отжиг синтезированных гомополимерных участков как на 5'-, так и на З'-концах вставки происходит случайным образом, что приводит к появлению плазмид со всеми возможными рамками считывания.
та появления 1ас+-колоний нередко превышает ожидаемые 5% [5, 6]. Это можно объяснить двумя способами. Во-первых, возможно, что ДНК-вставки содержат свои собственные инициирующие трансляцию кодоны. В пользу этого говорит высокая частота, с которой нам удавалось выделять б'-конец гена lac I. Во-вторых, небольшие фрагменты ДНК могут содержать более одной открытой рамки считывания.
Полилинкер pUK270 позволяет определять нуклеотидную последовательность химическим методом, начиная с обоих концов вставки, клонированной в PstI- или BglП-сайте [14, 15]. В то же время, используя Hindlll- и fcoRI-еайты полилинкера, вставку можно быстро переклонировать в векторы М13тр8 или тр9 [16] и определить ее последовательность ферментативным методом [17].
122
Глава 4
3. Клонирование в З'-концевой области гена lacZ
Мы разработали также серию векторов, пригодных для клонирования ДНК в З'-концевой области гена lac Z с образованием активных химерных ^-галактозидаз [12]. Эти же векторы используют и для клонирования кДНК, если желаемым продуктом является активная химерная р-галактозидаза. Наличие на З'-конце кДНК стоп-кодона делает обязательным использование этих векторов в тех случаях, когда необходимо добиться экспрессии химерных р-галактозидаз. кДНК-вставку из имеющегося клона можно переклонировать, используя Ps^I-сайт или другие сайты рестрикции. Нами сконструированы векторы для всех трех трансляционных рамок считывания [12]. Эти векторы, естественно, пригодны и для получения библиотек кДНК-Объем таких библиотек ограничен только эффективностью, с которой плазмидная ДНК трансформирует Е. coli.
Во всех случаях обязательно использование хозяина, продуцирующего /ас-репрессор в количествах, достаточных для эффективного подавления синтеза ?1-галактозидазы. Мы используем в качестве хозяина уже описанный в разд. 2 штамм F11 гес А. Обе системы клонирования можно приспособить для-А,-векторов. Плазмида pUR290 (рис. 3), один из векторов с различными трансляционными рамками считывания, несет ген lac Z с его регуляторной областью. Непосредственно перед, стоп-кодоном этого гена имеется полилинкер [12]. В противоположность pUK270 этот экспрессирующий вектор имеет генотип lac Z+. Колонии бактерий, несущих делецию хромосомного-/ас-оперона и содержащие эту плазмиду, окрашены в темносиний цвет при выращивании на богатой среде, содержащей IPTG и X-Gal. Между pUR290 и pUK270 существуют и другие-небольшие различия. pUR290 не содержит гена lac У и непригодна для селекции /ас+-рекомбинантов на агаре с лактозой на
Рис. 3. Плазмида pUK290, несущая ген lac Ъ с полилинкером в его З'-концевой’ области. Генотип плазмиды lacZ+,
Иммунологический метод выявления химерных ft-галактозидаз
123
©
PUK270
®
NH-
(5 Gal
z*
PUR290
Вставка
•СООН
Тетрамерюация с образованием активного фермента
Рис. 'A. A. pUK.270 с фрагментом. ДНК, клонированным в полилинкере на Б'-конце гена lac Z. Вставка кодирует N-концевую часть химерной [5-галакто-зидазы. Химерный фермент активен в виде тетрамера. Б. pUR290 с фрагментом ДНК, клонированным в З'-концевой зоне гена lacZ. Вставка кодирует С-концевую часть химерного белка.
фоне делеции lac X Y. Как указано в разд. 2, выход /ас-рекомбинантов при клонировании случайных фрагментов ДНК с присоединением dG/dC-концов в pUK270 составляет 5—10%. Тот же метод при использовании плазмиды pUR290 дает максимально 17% рекомбинантов, так как для успешного клонирования в нужной рамке считывания и ориентации должен быть вставлен лишь Б'-конец экзогенного фрагмента. Селекция рекомбинантных клонов в данном случае невозможна, поскольку pUR290 так же, как и рекомбинант, /ас-положительна. Клонирование ДНК в полилинкер pUR290 дает возможность производить определение нуклеотидной последовательности химическим методом с обоих концов [14, 15]. Наличие сайтов рестрикции для HindUl и ВатШ. позволяет переклонировать вставку в М13тр8 или тр9 для ферментативного определения последовательности [16, 17].
124
Глава 4
4. Практические методики
4.1. Материалы
4.1.1. Пластины для иммобилизации антител
Мы используем для этой цели пластины из поливинилхлорида (ПВХ). Они производятся фирмой Fa. Benneke Hannover-Vinnhorst. Торговое название материала — Bennecor, Acetella glasklar. Для защиты поверхности полимера от повреждений пластины с одной стороны должны быть покрыты тонким листом бумаги. Для того чтобы пластины можно было легко наложить на поверхность чашки с лизированными колониями бактерий, они (эти пластины) должны быть гибкими. Если материал излишне жесткий, то лизированные колонии будут подвергаться слишком большому давлению. Это приводит к размазыванию бактерий по всей пластине, на которой при этом появляется голубоватый фон. Старайтесь не прикасаться к той поверхности полимера, которая используется для связывания антител. Иногда на пластинах можно заметить небольшие серые образования; при промывках грязь с них не удаляется. К этим участкам белки прилипают неспецифически и при скрининге дают мощный положительный сигнал. Круглые пластины диаметром 8 см можно вырезать из больших листов с помощью-циркуля. Для этого грифель в нем нужно заменить на режущую кромку скальпеля или бритвенного лезвия. Такой инструмент обрезает край очень ровно. При использовании других инструментов на обрезанном краю пластика часто остаются мелкие шероховатости, которые могут привести к появлению неспецифического окрашивания.
Предыдущая << 1 .. 47 48 49 50 51 52 < 53 > 54 55 56 57 58 59 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed