Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2. Семейство pEMBL
Векторы семейств pUC или mp [1, 2] весьма универсальны, так как позволяют внедрять фрагменты чужеродной ДНК в различные рестрикционные сайты небольшого полилинкера, находящегося в кодирующей последовательности а-пептида ^-галак-тозидазы. При этом появляется возможность клонировать фрагменты ДНК в выбранной ориентации или в нужной трансляционной рамке считывания. Рекомбинантные клоны бактерий можно легко идентифицировать по их окраске на соответствующих индикаторных чашках, не прибегая к приготовлению, реплик.
Семейство одноцепочечных векторов pEMBL
133
Smal.Avol AccI.HincII
pEMBL 9 i______i., i________' i i
Hndlll Psfl Sail. BamHI Smal, EcoRI AccI,H«icII XmoI.Aval
pEMBL 18 i___________i____i______i_____i______i_____i_____i_____i____i
EcoRI SstlKpnl Xmol, BamHI Xbol Soli, Psfl SphI Hind III Smal.Aval AccI.HincII
pEMBL19 I. i_______________i_____I. i_________i i i i '
Hindlll SphI Psfl Soli, Xbal BamHI Xmol, Kpnl SstI EcoRI AccI.HincII SmoI.A^al
Рис. 1. Физическая карта плазмид pEMBL.
Для того чтобы расширить возможности применения этих плазмид, мы клонировали /JcoRI-EcoRI-фрагмент генома И (1300 п. н.) из плазмиды pD4 [3] в уникальном jVarI-сайте, имеющемся во всех плазмидах серии pUC. Сконструированные плазмиды (семейство pEMBL [5]) сохранили все свойства плазмид pUC. Они имеют тот же участок начала репликации, кодируют устойчивость к ампициллину и, кроме того, способны к синтезу a-пептида ^-галактозидазы. Бактерии, несущие такие плазмиды, на хромогенном субстрате 5-бромо-4-хлоро-3-индо-лил-^-О-галактозиде (X-Gal) образуют синие колонии. Обычно ген а-пептида в рекомбинантных плазмидах инактивируется и колонии бактерий на чашках с X-Gal оказываются бесцветными. Кроме того, плазмиды pEMBL содержат интактную область начала репликации фага f 1, которая активируется при суперинфекции клеток этим фагом. При этом происходит накопление одноцепочечной плазмидной ДНК, которая упаковывается и секрети-руется в культуральную среду в виде вирионоподобной частицы. Ориентация фрагмента ДНК И длиной 1300 п. н. определяет, какая из двух цепей будет упаковываться в вирусную частицу. Согласно этому, векторы обозначаются как pEMBL ( + ) й pEMBL(—). При использовании векторов pEMBL( + ) в продуцируемых клетками после суперинфекции вирионах содержится
134
Глава 5
некодирующая цепь р-галактозидазы, а в случае векторов pEMBL (—) вирионы содержат кодирующую цепь этого гена. ¦Физическая карта плазмид pEMJBL приведена на рис. 5.1.
3. Одноцепочечные плазмидные векторы для специальных целей
Возможность нарабатывать плазмидную ДНК в одноцепочечной форме полезна и в случае специализированных плазмид. В принципе любую из существующих плазмид можно превратить в плазмиду «типа pEMBL», если ввести в нее фрагмент, несущий участок начала репликации фага fl. Мы использовали этот подход для конструирования специализированных челночных дрожжевых векторов и эспрессирующих векторов для Е. coli.
Векторы pEMBLY — это семейство векторов, полученных из плазмиды pEMBL9 путем введения в ее уникальный CYaI-сайт различных фрагментов дрожжевой ДНК. Дрожжевая ДНК несет генетические детерминанты, которые можно использовать в качестве селективных маркеров на подходящих мутантных штаммах дрожжей (Бальдари и Чезарени, готовится к печати). Кроме того, некоторые из фрагментов дрожжевой ДНК способны поддерживать репликацию плазмид непосредственно в S. се-revisiae. Дрожжевые векторы, не содержащие области начала репликации ДНК, трансформируют дрожжевые клетки с низкой эффективностью [6]. Эти векторы называют интегрирующимися, так как стабильные трансформанты образуются в результате их генетической рекомбинации с гомологичными последовательностями хромосом. Дрожжевые плазмиды, несущие области начала репликации дрожжей, трансформируют клетки на три порядка эффективнее, чем интегрирующиеся векторы. Область начала репликации можно либо «позаимствовать» из эндогенной дрожжевой 2 мкм-плазмиды, либо ввести в виде ^-последовательности [7]. Ars-последовательности найдены в ДНК многих эукариот, и в дрожжах, вероятно, функционируют как области начала репликации [8]. Семейство pEMBLY включает плазмиды всех этих типов, а также векторы, позволяющие отбирать трансформанты по комплементации генов LEU2, URA3 или TRPI. Физические карты плазмид pEMBLY приведены на рис. 2. Для клонирования используют уникальные рекстрикционные сайты, расположенные в области, кодирующей a-пептид ^-галактози-дазы.
Второй вид специализированных одноцепочечных плазмидных векторов «типа pEMBL» предназначен для экспрессирующих систем. Нашей целью было создать экспрессирующий вектор, в котором синтез интересующего исследователя белка направляется инициирующим AUG-кодоном вектора. Впоследствии можно
Семейство одноцепочечных векторов pEMBL
