Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
С того времени, как нами впервые были описаны активные-химеры р-галактозидазы [1], разработано много систем клонирования, использующих тот факт, что 25 N-концевых остатков. [}-галактозидазы можно без нарушения ее активности заменить полипептидом любого размера и происхождения [2—11]. В этой, главе мы опишем векторы такого типа, разработанные в нашей лаборатории. Наши векторы позволяют клонировать чужеродную ДНК как в 5'-, так и в З'-концевой области гена lac Z [5, 12]. Клонированную ДНК можно экспрессировать в виде химерной [}-галактозидазы. Клонирование ДНК в 5'-концевой области гена lac Z приводит к появлению продуктов слияния, в которых вставка кодирует N-концевую область активной р-галактозидазы. В результате клонирования в З'-концевой зоне' гена lac Z появляется такой продукт, в котором вставкой кодируется С-концевая область активной р-галактозидазы. ДНК с известной последовательностью можно вставить непосредственно в виде рестриктного фрагмента в соответствующую рамку считывания гена lac Z. Если последовательность ДНК неизвестна, ее можно клонировать при помощи достроенных dG/dC-концов. В этом случае лишь некоторая часть рекомбинантов будет сформирована с соблюдением рамки считывания и требуемой ориентации вставки. Мы обнаружили, что при подходящих условиях большая часть (хотя и не все) химерных р-галактозидаз стабильна на 90%. В дальнейшем мы объясним, почему применение (3-галактозидазы в качестве фермента-носителя дает возможность выделять и очищать все химерные
антигены одним и тем же методом. При использовании этого фермента выявление нужных клонов можно проводить, анализируя их (3-галактозидазную активность [5, 6].
2. Клонирование в 5 -концевой области гена lac Z
Плазмида pUK270 (рис. 1) содержит полный /ас-оперон: ген lac Z с мутацией сдвига рамки в полилинкере, находящемся в проксимальной части промотора, ген lac У и часть гена lac А. Бактерии, несущие pUK270, не могут расти на чашках с минимальным агаром и лактозой, если у них делетирован хромосомный /ас-оперон. Используемый нами в качестве хозяина штамм F11 гес А имеет делецию (lac pro) и содержит эписому F' lac pro. Эписома экспрессирует /ас-репрессор с промотора Iql и несет делецию всего гена lac Z. В то же время она активна по
и
ACG
ACG CCA AGC ТТТ СТА GAG АТС ТТС CAT ACC ТАС С AG ТТС ПТ С
Hind П1 XbQi Bglll
6
ТСА
GCC TGC А6С ААТ GGC AAG А AC GTT GCC CGG АТС CGG GGA ATT СА
Pst I BamHI EtoRI
Рис. 1. Плазмида pUK270 содержит ген lac Z, ген lac У и часть гена lac А. Мутация со сдвигом рамки в области полилинкера превращает плазмиду в lac Z~.
RI
HindlH-Xbal Bglll Pstl BamHI EcoRI
Фрагмент W/ndffl/fcoRl -74п.н. Фрагмент WmdlIl/PifI‘-A3n.H. Фрагмент Pstl/EcoRl '•'51п.н.
120
Глава 4
/ас-пермеазе. Следует подчеркнуть, что этот штамм нельзя заменить каким-либо другим, хорошо трансформирующимся. Штамм, используемый в качестве хозяина, должен быть сверхпродуцентом lac-репрессора для того, чтобы плазмидные гены lac Z в отсутствие индукции находились в репрессированном: состоянии. Присутствие больших количеств /ас-репрессора препятствует полной экспрессии плазмидных генов lac Z даже при наличии лактозы или индуктора изопропил-1 -тио-^-О-галакто-зида (IPTG). Это обусловливает стабильность lac-оперона плазмиды. Гиперэкспрессия ^-галактозидазы неблагоприятна для роста клеток и приводит к накоплению мутантных плазмид,, имеющих дефекты во вставке и /ас-опероне. Колонии несущих плазмиду pUK270 клеток F11 гес А при росте на богатой среде, содержащей IPTG и гистохимический краситель 5-бромо-4-хло-ро-З-индолил-^-О-галактозид (X-Gal), имеют бледно-голубую-окраску, что свидетельствует о небольшой фоновой экспрессии ^-галактозидазы. То же наблюдается и при использовании сходных векторов pUK230 и pUK250, сконструированных ранее-[5, 13]. Причиной этой остаточной активности может быть функционирование слабого побочного промотора или супрессия мутации сдвига рамки. В любом случае эта активность не мешает работе с вектором. Плазмида pUK270 предназначена для клонирования ДНК с известной последовательностью в любом из шести рестрикционных сайтов полилинкера, но в основном для клонирования в участке Pst I случайных фрагментов ДНК с использованием достроенных dG/dC концов.
Рекомбинантные клоны можно отбирать по сбраживанию лактозы на содержащей ее минимальной среде либо на богатой среде с Добавлением IPTG и X-Gal. Однако при прямом рассеве трансформантов на минимальной среде с лактозой эффективность трансформации понижается примерно на порядок. Вот почему мы сначала рассевали трансформанты на чашках с богатой средой, содержащей ампициллин, а затем отбирали /ас-положительные трансформанты, перенося колонии на минимальную среду с лактозой. Можно также отбирать рекомбинанты на чашках с богатой средой, содержащей IPTG, X-Gal и ампициллин, по ярко-синему цвету колоний. При клонировании случайных фрагментов ДНК с присоединением dG/dC-концов число 1ас+-колоний составляет 5—10% от общего числа трансформантов. Фрагменты экзогенной ДНК способны отжигаться с векторной ДНК в двух ориентациях и шести возможных рамках считывания (рис. 2).
