Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
5. Общие замечания
Рекомбинантные плазмиды, введенные в клетки F11 гес А, стабильны и продуцируют большие количества химерных J5-ra-лактозидаз. Исключение из этого правила представляют собой химерные ^-галактозидазы, возникающие в результате реинициации синтеза белка в области ДНК-вставки, клонированной в 5'-концевой зоне гена lac Z. В большинстве случаев длина субъединицы химерного белка (по данным SDS-электрофореза) пропорциональна длине вставки. При отборе клонов с помощью антител одновременно происходит селекция на стабильность антигена. Тем не менее для того, чтобы гарантированно обеспечить стабильность химер, мы выращиваем клетки при комнатной температуре. По нашим наблюдениям вставки, окруженные poly-Gly или poly-Pro, стабильны. Стабильность обычно высока, если экспрессируемый полипептид включает полную структурную единицу (белковый домен). В З'-концевой области гена lacZ имеет смысл клонировать лишь С-концевые последовательности белка, а не его внутренние фрагменты. В тех случаях, когда ДНК-вставка кодирует сильно гидрофобные полипептиды, например лидерные или внутримембранные последовательности,, химерный белок может оказаться нерастворимым. Для идентификации антигенов, экспрессируемых последовательностями, которые клонированы в 5'- или З'-областях гена lacZ, можно использовать меченный иодом А-белок [25]. Результаты, полученные с помощью этого метода, а также описанного выше иммуно-ферментного метода, оказались сходными.
Особенно важно то, что при поиске клонов нет необходимости знать структуру антигена. Нужны лишь антитела к этому антигену и экспрессируемая библиотека достаточного объема. Описанную нами систему клонирования можно приспособить и для векторов на основе фага К. По нашему мнению, именно здесь кроются возможности для дальнейшего усовершенствования и применения метода.
Иммунологический метод выявления химерных fl-галактозидаз
131
Литература
1. МйИег-Hill В., Kania I. Nature, 249, 561 (1974).
2. Roberts Т. М., Kacich R., Ptashne M. Proc. Natl. Acad. Csi USA, 76, 760 (1979).
3. Guarente L., Lauer G„ Roberts Т. М., Ptashne M. Cell, 20, 543 (1980).
4. Casadaban М. J., Martinez-Arias A., Shapira S. K., Chou J. In: Methods In Enzymology, Wu R., Grossman L. and Moldave U. (eds.). Academic Press, New York, p. 293, 1983.
5. Koenen M„ Rather U„ МйИег-НШ В. EMBO J„ 1, 509 (1982).
6. RUther U., Koenen М., Sippel A. E., Miiller-Hill B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6852 (1982).
7. Gray M. R„ Colot H. V., Guarente L., Rosbash M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6598 (1982).
8. Zabeau М., Stanley К. K. EMBO J., 1, 1217 (1982).
9. Weinstock G. М., Aprhys C., Berman M. L., Hampar B., Jackson D., Silha-vu T. J., Weisemann J., Zweig M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4432 (1983).
10. Weis H J. Enquist L. W., Salstrom J. S., Watson R. J. Nature, 302, 72 (1983).
11. Roy A., Danchin A., Josef E., Ullmann A. J. Mol. Biol., 165, 1.97 (1983).
12. Rather U„ МйИег-Hill B. EMBO J., 2, 1791 (1983).
13. Rather U. Thesis, Cologne, 1983.
14. Maxam A. M„ Gilbert W. In: Methods in Enzymology, Grossman L„ and Moldave K. (eds.), Academic Press, New York, Vol. 65, p. 499 (1980).
15. Rather U. Nucleic Acids Res., 10, 5765 (1982).
16. Messing J., Vieira J. Gene, 19, 269 (1982).
17. Sanger F„ Nicklen S., Coulson A. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463
(1977)
18. Miller J. M. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972.
19. Porter R. R. Biochem. J., 73, 119 (1959).
20 Hanahan D. Meselson M. In: Methods in Enzymology, Wu R„ Grossman L. and Moldave K. (eds.), Academic Press, New York, Vol. 100, p. 333 (1983).
21. Steers E. J., Cuatrecasas P., Pollard H. B. J. Biol. Chem., 246, 196 (1971).
22. Ullmann A. Gene, 29, 27 (1984).
23. Laemmli U, K. Nature, 227, 680 (1970).
24. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. J. Biol. Chem., 193, 265 (195 i)
25. Kemp D. J., Coppel R. L., Cowmann A. F., Saint R. B., Brown G. V Ankers R. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3787 (1983).
9*
ГЛАВА 5
СЕМЕЙСТВО ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ ВЕКТОРОВ pEMBL
Лючиана Денте, Маурицио Соллаццо, Козима Бальдари, Джанни Чезарени и Рикардо Кортесе
1. Введение
Одноцепочечные векторы применяются во многих лабораториях для определения нуклеотидной последовательности ДНК, направленного мутагенеза, S1-картирования и приготовления одноцепочечных зондов для гибридизации. Наиболее широко используются разработанные Мессингом с соавт. [1, 2] производные М13. На практике, однако, применение векторов на основе М13 имеет некоторые ограничения. Неоднократно наблюдалось, например, что вставки большого размера в этих векторах нестабильны. Кроме того, во многих случаях необходимо клонировать фрагмент ДНК в плазмидах, сконструированных для определенных целей. Это могут быть челночные плазмидные векторы, способные размножаться в клетках либо прокариот, либо эукариот, или же векторы, предназначенные для экспрессии в обеих этих системах. Было бы удобно, если бы любую специализированную плазмиду можно было получать в одноцепочечной форме, пригодной для определения нуклеотидной последовательности, направленного мутагенеза и т. п. Дотто с соавт. клонировали в fcoRI-сайте плазмиды pBR322 область генома фага И* содержащую все цис-действующие элементы, необходимые для репликации ДНК и морфогенеза [3, 4]. Эти же исследователи показали, что при суперинфекции несущих такую плазмиду клеток фагом И примерно половина секретируемых в культуральную среду вирионов несет одноцепочечную ДНК Н, а другая половина — одноцепочечную ДНК pBR322. Мы использовали этот факт для конструирования нового семейства векторов.
