Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Если важны надежность и воспроизводимость результатов-(что имеет место в большинстве случаев), существенное значение приобретает подготовка культуры Е. coli для трансформации. Хорошо трансформирующиеся клетки можно вырастить, при различных условиях, но наиболее эффективна следующая процедура. Из хранящейся при —70 °С культуры отбирают немного клеток, рассеивают их штрихом на чашке со средой SOB и инкубируют при 37 °С до тех пор, пока колонии не достигнут 2,5—3 мм в диаметре. Колонии отбирают и суспендируют в 1 мл среды SOB, засевают ими больший объем среды и инкубируют культуру на качалке при 37 °С до тех пор, пока титр ее не достигнет 5—7-107 жизнеспособных клеток/мл. Культуру переносят
in*
Глава 6
в охлажденные центрифужные стаканы и используют для трансформации. Могут подойти и другие методы хранения и подготовки клеток, но ни один из них, по опыту автора, не дает таких надежных результатов. Свежие столбики, свежий пассаж культуры на чашке, клетки, медленно растущие при комнатной температуре, — все эти варианты инкубации клеток могут использоваться в опытах по трансформации, однако результаты при этом нестабильны. Клетки, полученные из столбиков или чашек, хранившихся при 4 °С, либо из суспензий, хранившихся при —20 °С в 50%-ном глицерине, обычно ненадежны. Биологические причины невоспроизводимости трансформации при таком способе хранения клеток остаются неясными. Описанная выше процедура позволяет добиться воспроизводимых результатов, однако не претендует на объяснение этих причин.
Важнейший фактор, влияющий на эффективность трансформации, — чистота используемых реагентов. В то же время относительно большие отклонения во времени инкубации на большинстве стадий в скоростях и продолжительности центрифугирования, в концентрациях компонентов вполне допустимы. Основные загрязнения, влияющие на трансформацию,— это, видимо, органические примеси в воде и продукты окисления ДМСО. Если обеспечено хорошее качество воды и ДМСО, высокая эффективность трансформации достигается легко. ^Критерии качества этих реагентов обсуждаются в разд. 5. Еще одна причина возможной неудачи при трансформации — загрязнения, связанные с пластиком и детергентами. Использование при трансформации стеклянной посуды может неблагоприятно повлиять на компетентность клеток. По-видимому, это связано с вредным воздействием органических соединений, загрязняющих автоклав при стерилизации пластиковых отходов, ,а также с неполным удалением используемых при мойке детергентов. Вот почему следует иметь комплект посуды только для трансформации. Эту посуду после работы тщательно споласкивают, автоклавируют, наполовину заполнив водой, и промывают перед работой стерильной водой или средой. Кроме того, некоторые из используемых для стерилизации мембран (например, Nalge) могут быть пропитаны смачивающими агентами, например детергентом Тритон Х100. Такие фильтры перед стерилизацией TFB и культуральных сред следует 1—
2 раза промыть водой.
Следующий источник загрязнений — поверхностно-активные вещества, попадающие на пластиковую посуду в процессе изготовления. Некоторые марки полипропиленовых пробирок (например, Sarsted) необходимо хорошо прополаскивать перед использованием, иначе эффективность трансформации в них окажется низкой. В приводимой методике нельзя исполь-.зовать пробирки из полистирола, так как они слегка растворя-
Методы трансформации Е. coli
149
ются в ДМСО, а растворенный материал заметно ингибирует трансформацию. Вместо -полипропиленовых пробирок можно использовать стеклянные. Следует, однако, подобрать время теплового шока, так как теплопроводность стекла иная, чем полипропилена, а толщина стенок меняется в зависимости от марки пробирок.
Еще одна возможная причина неудач в опытах по трансформации связана с реактивами и экстрактами, использующимися для выращивания и приготовления клеток. Гидролизаты казеина и дрожжевые экстракты, как правило, эквивалентны. Иногда эти продукты оказываются некачественными. В частности, одна из партий дрожжевого экстракта (фирмы Oxoid) была непригодной для приготовления компетентных клеток. Обычно реактивы довольно долго сохраняют свою стабильность, но при этом они не свободны от появления загрязнений и. от некоторого разложения при хранении. MES, например, разлагается при длительном хранении в сухом виде при комнатной температуре. Выяснить, какой именно реактив некачественный, можно, лишь заменяя их по очереди свежими. Ранее в состав стандартного буфера для трансформации (TFB) в качестве моновалентного катиона вводили RbCl. Однако оказалось, что его вполне можно заменить значительно более дешевым КС1 [15], который и включен в рекомендованный нами буфер. Необходимо использовать К.С1 наивысшей чистоты, так как он присутствует в TFB в высокой концентрации. TFB весьма устойчив; готовый буфер, хранившийся при 4°С 2 года, оказался не хуже свежеприготовленного.
При использовании стандартной методики частота трансформации приобретает нелинейный характер уже в интервале 1—5 нг ковалентно замкнутой ДНК pBR322, а все компетентные клетки в популяции насыщаются в присутствии 100— 200 нг плазмидной ДНК. Нужно отметить, что при добавлении более 25 нг плазмидной ДНК становится заметной частота появления двойных трансформантов [15]. Вот почему целесообразно, чтобы количество кольцевой (способной к трансформации) ДНК в реакции трансформации не превышало 10 нг. В тех случаях, когда значительная часть плазмидной ДНК находится в неспособной к трансформации форме, количество ДНК можно повысить, не забывая, однако, что любая ДНК становится конкурентоспособной, если ее концентрация составляет 25—100 нг на 108 клеток.
