Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
1S2
Глава 6
ном состоянии хранятся лишь нетрансформированные клетки Е. coli; часто используемые трансформированные штаммы можно держать в столбиках агара, а остальные плазмиды — в виде ДНК при —20 °С.
4.4. Хранение компетентных клеток в замороженном состоянии
Компетентные для трансформации клетки Е. coli можно-хранить в этом состоянии длительное время при температуре —70 °С или ниже. Существует несколько модификаций процедуры трансформации, приспособленных для приготовления и использования замороженных компетентных клеток. Основное их преимущество в том, что можно сразу приготовить большое количество компетентных клеток и расходовать их по мере надобности в течение многих месяцев. Со временем эффективность трансформации таких клеток уменьшается. Доля1 жизнеспособных и компетентных клеток в препарате после оттаивания обычно ниже, чем в свежем. Поэтому замороженные компетентные клетки нельзя рекомендовать для тех случаев,, когда необходимы наивысшая частота трансформации и наибольший колониеобразующий потенциал, например, для получения библиотек кДНК из ограниченного количества исходной ДНК-
Методы приготовления замороженных компетентных клеток приведены в табл. 6—8. Во всех методиках в качестве стаби-
Таблица 6. Трансформация с использованием замороженных клеток
(методика 1)
А. Приготовление клеток
1. С помощью простерилизованной в пламени горелки вольфрамовой петли отберите с чашки несколько свежих колоний диаметром 2—3 мм и суспендируйте клетки на встряхивателе в 1 мл среды. При отборе клеток старайтесь не захватить кусочков агара.
2. Засейте суспендированными клетками колбу Эрленмейера со средой. Одной колонией засевают 10 мл среды. Объем среды должен составлять менее 10% объема колбы. Рекомендуется среда SOB (в зависимости от штамма с добавлением или без добавления Mg2+).
3. Проинкубируйте культуру при 37 °С и умеренном встряхивании до' тех пор, пока она не достигнет середины логарифмической фазы роста и не будет содержать 4—9-107 жизнеспособных клеток/мл.
4. Перенесите культуру в центрифужные пробирки (например, 50 мл полипропиленовые пробирки Falcon 2070) и охладите во льду 10—60 мин.
5. Осадите клетки центрифугированием при 750—1000 g (~2000— 3000 об/мин в стандартной центрифуге) 15 мин при 4°С. Слейте надосадок и поставьте пробирки ненадолго вверх дном на бумажное полотенце, при необходимости слегка постучав по ним для удаления остатков жидкости.
6. Ресуспендируйте клетки в буфере для замораживания (FB)>> в объеме,
равном '/з объема исходного объема культуры, либо на встряхивателе при небольшой скорости, либо набирая и выпуская суспензию из пипетки. Проинкубируйте 10—60 мин во льду.
Методы трансформации Е. coli
153
Продолжение
7. Осадите клетки центрифугированием 15 мин при 750—1000 g. Тщательно удалите надосадок (см. стадию 5).
8. Суспендируйте клетки в FB в Vi2,5 исходного объема культуры. Таким ¦образом, 2,5 мл культуры концентрируются в 200 мкл FB. Такой объем является стандартным для трансформации.
9. Разлейте клетки по 200 мкл в 2 мл полипропиленовые пробирки с завинчивающейся крышкой или в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки.
10. Быстро заморозьте клетки в смеси сухого льда с этанолом или в жидком азоте и оставьте там на несколько минут.
11. Храните пробирки при —70 °С или в жидком азоте.
Б. Использование замороженных клеток
1. Достаньте пробирку из холодильника и выдержите на воздухе при комнатной температуре. Как только суспензия клеток оттает, перенесите пробирку в лед. (Если клетки были заморожены в большом объеме, разлейте их в отдельные пробирки по 200 мкл).
2. Добавьте раствор ДНК в объеме <20 мкл. Размешайте ДНК, вращая пробирку между ладонями.
3. Проинкубируйте пробирку во льду 10—60 мин.
4. Поместите пробирку на водяную баню с температурой 42 °С на 90 с (тепловой шок), затем быстро охладите до 0°С (во льду).
5. Добавьте 800 мкл среды SOC2> и проинкубируйте при 37 °С с умеренным встряхиванием 30—60 мин3».
') Состав буфера FB приведен в табл. 10.
2) Состав среды SOC приведен в табл. 12.
3) Прн трансфекции М13 эта стадия не нужна.
Таблица 7. Трансформация с использованием замороженных клеток
(методика 2)
А. Приготовление клеток
1. С помощью стерильной вольфрамовой петли отберите несколько свежих колоний диаметром 2—3 мм, выращенных на чашках со средой SOB, и диспергируйте их на встряхивателе в 1 мл среды SOB. Для получения свежих колоний лучше всего рассеять клетки на чашке штрихом из замороженного образца или свежего столбика агара за 16—20 час до приготовления жидкой культуры.
2. Засейте клетками колбу Эрленмейера со средой SOB. Одной колонией засевают 10 мл среды. Отношение объема культуры к объему колбы должно составлять от 1 : 10 до 1:30 (т. е. 30—100 мл на колбу объемом 1 л).
