Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Недавно Лоцза [784] обратил внимание на необходимость соответствующей фиксации липопротеидов перед их окрашива-
нием. С помощью метода отпечатков на фильтровальной бума» ге он сравнил различные способы фиксации и нашел, что водный и спиртовой растворы уксусной кислоты, а также водные растворы этанола и метанола не дают нужного эффекта. 2,5%-ный или 5%-ный водный раствор формальдегида [1359], а также смесь насыщенного водного раствора пикриновой кислоты с 20%-ной уксусной кислотой [278] достаточно прочно фиксируют липопротеиды. Особенно хорошие результаты получаются при использовании 1%-ного раствора уранилацетата, поскольку он не только обеспечивает адекватную фиксацию, но и повышает способность липопротеидов связывать краситель.
Зайдель и др. [1165] выявляли липопротеиды после электрофореза в агарозном геле путем осаждения их сульфатом декстрана. Сразу же после электрофореза гели помещают на 1 ч в ванночку, содержащую 0,6% натриевой соли декстран-сульфата 2000 (фирма Pharmacia) в 0,2 М СаС12. Авторы нашли, что при таком методе осаждаются почти все липопротеиды, за исключением небольшой их части (менее 5%). Они выявляются в виде белых мутных полос на прозрачном фоне.
При электрофорезе в агарозе или на ацетате целлюлозы липопротеиды разделяются в основном на фракции хиломикро-нов, р-, пре-p- и ai-липопротеидов (см. рис. 111). В агарозном геле хиломикроны остаются на старте, а на ацетате целлюлозы часть их мигрирует с фракцией пре-р-липопротеидов [769]. Вин-кельман и др. [1435] нашли, что при некоторых формах гипер-липемии (типы I и V), характеризующихся высоким содержанием хиломикронов, часть этих липопротеидов при электрофорезе остается на линии старта, что позволяет определить форму гиперлипемии. В ряде исследований была обнаружена множественность полос липопротеидов в зоне пре-р [593, 968]. Установлено, что липопротеид, мигрирующий в медленной части зоны пре-p, содержит антиген Lp(a) [1079, 1357]. По плотности этот липопротеид относится к классу ЛНП («осаждающихся пре-p») и представляет собой комплекс ЛНП, белка Lp(a) и альбумина [1331]. В зоне ai-липопротеидов обычно видны две полосы. Относительно природы более быстрой из этих фракций в литературе существуют противоречивые мнения. Некоторые авторы считают, что это альбумин, который благодаря адсорбированным на нем жирным кислотам может связывать липофильные красители [328, 1025]. Вместе с тем Берёндс и др. [109] приводят данные, указывающие на липо-протеидную природу этой зоны. Костнер и др. [713] обнаружили, что две указанные фракции ai-липопротеидов, разделяемые в агарозном геле, различаются по их взаимодействию с антителами против аполипопротеидов: обе фракции осаждаются антисывороткой против аполипопротеида AI, но только быстра
мигрирующая фракция взаимодействует с антисывороткой против аполипопротеида All.
При механической желтухе в плазме больных обнаруживается особый липопротеид (Lp-X), который по своей плотности принадлежит к ЛНП и обладает характерным липидным и белковым составом. Выявление Lp-X на электрофореграмме основано на его миграции к катоду при обычных условиях электрофореза в агаровом геле. Для увеличения катодной подвижности Lp-X пластины агарового геля необходимо выдерживать перед электрофорезом не менее 6 ч [990, 1166]. Надежная локализация этого белка стала возможной благодаря применению специфических антисывороток [1164]. Петек и др. [990] сравнили три различных способа проведения иммунопреципитации. При первом способе антисыворотку помещают в канавки, подобно тому как это делается при иммуноэлектрофорезе по методу Шайдеггера. Во втором способе после электрофореза в геле вырезают круглые лунки для антител на расстоянии 4 мм от лунок для антигена. В обоих случаях время, необходимое для диффузии, составляет 12—16 ч. Второй способ является более экономным с точки зрения расходования антисыворотки. При использовании третьего способа (иммунофиксация) антисыворотку прямо наносят на поверхность геля на расстоянии
3—5 мм от каждой лунки с антигеном со стороны катода. Для образования зон преципитации требуется от 10 мин до 3 ч. Чувствительность этого метода выше, чем двух первых, однако для его проведения необходимо значительно больше антисыворотки. Иногда Lp-X мигрирует к катоду недостаточно быстро, и в этих случаях для его обнаружения можно применять только первый из указанных способов. Вместо иммунопреципитации Зайдель и др. [1165] проводили осаждение Lp-X гепарином. После электрофореза гели помещают в 0,25%-ный раствор гепарина в 0,9 М NaCl, содержащий 0,1 М MgCl2. Осаждение заканчивается в течение 30 мин. Такая методика, по-видимому, вполне приемлема для клинических лабораторий.
Липопротеидный состав, полученный описанными выше электрофоретическими методами, сравнивали с картиной их разделения, которую дает дифференциальное ультрацентрифу* гирование. Была найдена достаточно хорошая корреляция между результатами ультрацентрифугирования и данными электрофореза на бумаге [752], в агарозном геле [526, 931] и на целлогеле [109]. Этот факт свидетельствует о том, что применение простых электрофоретических методов при изучении липопротеидного состава дает информацию, вполне сравнимую с той, которую получают с помощью более дорогостоящего и трудоемкого способа ультрацентрифугирования. Относительно простые приемы электрофореза можно использовать для клас-
