Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
А
Количество
Количество
а а2+Х м
J\?js^uTcm
гт
s} >w~Yr**!P
ЛОНП —ш'20
r9Flt2o \0
Б
Количество
Чльтрацентр1 круга
Рис. 111. Корреляция между классами липопротеидов сыворотки, различающимися по плотности, и фракциями липопротеидов, полученными с помощью различных электрофоретических методов [769]. А. Электрофорез на бумаге. 5. Электрофорез в агарозном геле. В. Электрофорез на ацетате целлюлозы. Л Электрофорез в полиакриламидном геле. Хм— хиломикроны, ЛОНП— липиды с очень низкой плотностью, ЛНП— липиды с низкой плотностью, ЛВП — липиды с высокой плотностью, / — стартовый гель, 2—концентрирующий гель, 3 — разделяющий гель.
образцы плазмы вполне могут быть использованы для анализа [1032, 1436].
В 50-х и в начале 60-х годов в качестве поддерживающей среды широко использовали бумагу. Основная трудность при этом была связана с адсорбцией на ней липопротеидов, что приводило к появлению «хвостов» и плохому разделению.
Добавление в буферный раствор альбумина [752] значительно облегчило разделение липопротеидов путем электрофореза на бумаге. В такой модификации электрофорез на этой поддерживающей среде оказался вполне приемлемым для клинических анализов. Насыщение адсорбирующей способности фильтровальной бумаги альбумином предотвращает взаимодействие липопротеидов с бумагой. Вследствие этого зона Pi суживается и зона пре-p (ЛОНП) частично отделяется от зоны ЛНП, при*
чем хвосты образуются лишь при высокой концентрации ЛОНП.-.Лиз и Хэч [752] использовали бумагу 2043 А фирмы Шляйхер' и Шуль и вероналовый буфер (pH 8,6; ju = 0,l), содержавший 1 мМ ЭДТА и 1%-ный альбумин. Пленки из ацетата целлюлозы обладают значительно меньшей адсорбционной способностью по сравнению с фильтровальной бумагой, поэтому они являются/ .по-видимрму, более подходящей поддерживающей средой для электрофореза липопротеидов [1434, 1435]. Однако при использовании ацетата целлюлозы встречается другая сложность, а именно, значительное сродство ацетата целлюлозы к красителям, применяемым для обнаружения липопротеидов. Вначале для решения этой проблемы был предложен особый метод окрашивания электрофореграмм: ненасыщенные жирные
кислоты после электрофореза окисляли в герметичной камере озоном и содержавшие их зоны обнаруживали с помощью реакции Шиффа [696]. Эта процедура довольно сложна и вряд .ли годится, даже для полуколичественного определения, поскольку результаты такого анализа плохо коррелируют с данными, полученными при обычных способах окрашивания. В качестве альтернативного подхода было использовано окрашивание масляным красным О с последующим отбеливанием элект* рофореграмм в растворе гипохлорита или гипобромита [386, 688]. Для электрофореза липопротеидов был также с успехом применен желатинизированный ацетат целлюлозы, при этом процедура окрашивания включала деацетилирование пленки в щелочном растворе. Последний этап можно осуществлять до окрашивания [109, 242], одновременно с ним [1338] или после него [864]. По методике Кольфса и Ферхайдена [242], деаци-тплирование проводят в 33%-ном растворе КОН, причем длительность обработки щелочью (20 с) имеет исключительно важное значение. Другие авторы применяют обработку 2,5— 5,5%-ным спиртовым раствором NaOH, которая продолжается в течение более длительных периодов времени. Для окрашивания можно использовать масляный красный О, жирный красный 7В или судановый черный В. Что касается условий электрофореза, то большинство авторов применяет обычные верона-ловые буферы, слегка различающиеся по значению pH (8,2—
8,6) и ионной силе (0,035—0,08). Клеменс и Шальбек [688] считают преимуществом ацетата целлюлозы то, что при ее использовании нет необходимости включать в буфер альбумин, тогда как Грос и Жермен-Грос [483] предлагают пропитывать пленки из ацетата целлюлозы 0,5%-ным альбумином. Влияние альбумина на электрофоретическое разделение в этом случае выражено не так сильно, как при электрофорезе на бумаге.
Электрофореграммы на агаровом геле можно окрашивать обычными красителями для липидов, однако здесь возникает
другая серьезная проблема, а именно влаимодействие липопро-теидов с таким сильно заряженным полианионным веществом, каким является агар. Этот эффект в сочетании с сильным элект-роосмотическим током мешает разделению липопротеидов. В то же время агарозный гель оказался превосходной средой для электрофоретического разделения липопротеидов сыворотки. В продаже имеются готовые к употреблению агарозные гели, предназначенные для разделения липопротеидов. Рапп и Кальке [1059] применяли 0,8%-ный агарозный гель в 0,025 М бар-биталовом буфере (pH 8,2) и проводили разделение на стеклянных пластинках размером 12X9 см при напряжении 10 В/см. Нобл [930] использовал гель, содержавший 0,4% агарозы и 0,12% агара в 0,05 М барбиталовом буфере (pH 8,6). Агар добавляется для повышения механической прочности геля, так как при низких концентрациях агарозы, необходимых для эффективного разделения липопротеидов, образуются недостаточно прочные гели. (Следует отметить, что разные партии агарозы отличаются по многим показателям, в том числе по механической прочности* поэтому для установления оптимальной концентрации геля рекомендуется проводить предварительные опыты [630]). К смеси добавляют сывороточный альбумин быка в конечной концентрации 0,5%. Теплый золь агара распределяют по поверхности полосок (15X3,5 см) или листов (15Х Х35 см) тонкой полиэфирной пленки кронар (фирма du Pont). Электрофорез проводят на пластинке с водяным охлаждением при постоянном токе 2,3—2,8 мА на 1 см ширины геля. Па-падопулос и Кинциос [969] применяли 0,5%-ный агарозный гель и осуществляли электрофорез по методу [967], сходному с методом Виме [1419]. Согласно методу Раппа и Кальке [1059], а также варианту А метода Нобла [930], сыворотку смешивают с теплой агарозой и в таком виде вносят в лунки, вырезанные в геле. В варианте В метода Нобла [930] сыворотку или плазму прямо вносят в узкие щели, вырезанные в геле по шаблону. В последнем случае электрофорезу подвергают 20 мкл сыворотки или плазмы, тогда как по методу Пападо-пулоса и Кинциоса [969, 970] достаточно 3 мкл сыворотки. Добавление к буферу, на котором готовится гель, альбумина приводит к некоторому расширению зон липопротеидов, и они принимают более правильную форму. На электрофореграммах, полученных Пападопулосом и Кинциосом [969, 970], хорошо очерченные зоны видны и при отсутствии альбумина в буфере, что, вероятно, обусловлено очень коротким временем разделения при высоком напряжении и эффективном охлаждении пластинки.
