Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ское значения этих вариаций обсуждаются в более ранней статье того же автора [723].
Фейджерхол [355] предложил метод высоковольтного горизонтального электрофореза в крахмальном геле с неоднородной-буферной системой (метод подробно описан в монографии Гиб-летта [433]). Присутствие одного из вариантов агантитрипсина удалось также обнаружить путем электрофореза в агарозном геле [356, 742]. Для подтверждения наличия этого варианта в крови, а также для его идентификации на втором этапе был осуществлен электрофорез в геле, содержавшем антитела к агантитрипсину. Особенно четкие картины разделения получают при проведении в первом направлении электрофореза в крахмальном геле, а во втором — электрофореза в агаровом геле с антителами (рис. 106) [356]. Для идентификации гетерозиготных фенотипов по генам, ассоциированным со сниженным уровнем антитрипсина в сыворотке, Купперс [722] применил; перекрестный иммуноэлектрофорез.
Группоспецифический компонент (Gc). В 1959 г. Хиршфельд [556] сообщил от открытии вариантов аг-глобулина человека* отличного от гаптоглобина (полиморфизм последнего был установлен еще раньше). Эти варианты были обнаружены путем иммуноэлектрофореза сыворотки. В дальнейших исследованиях установлено, что все три распространенных варианта представ* ляют собой фенотипическое проявление пары кодоминантных аллелей [559].
В ряде случаев были обнаружены редкие варианты [239*
Для определения фенотипа Gc чаще всего используют иммуноэлектрофорез в агаровом геле. Хиршфельд [557, 558] разработал модификацию микрометода Шайдеггера, в которой применяется неоднородная буферная система Лорелла [739].
Лунки для антигена размещают таким образом, чтобы можно было осуществлять длительный электрофорез компонентов, мигрирующих к аноду. В лунку вносят 5 мкл сыворотки и электрофорез проводят в течение 2 ч при напряжении 7—8 В/см. Некоторые авторы используют удлиненные стеклянные пластинки и увеличивают время электрофореза [682, 1071]. Для иммунопреципитации применяют антисыворотки с высоким титром антител или, что более предпочтительно, моноспецифиче-ские антисыворотки против группоспецифического вещества.
Разделение группоспецифических веществ осуществляют также с помощью вертикального электрофореза в крахмальном геле [95, 973]. Группоспецифические вещества располагаются при этом в постальбумйновой области. У каждого типа гомозигот группоспецифический белок представлен двумя зонами, причем более медленная зона Gel мигрирует с той же скоростью, что и более подвижная зона Gc2. У гетерозигот наблюдаются три зоны [681].
Кичин и др. [681, 682] применяли вертикальный электрофорез в пластинах 5%-ного полиакриламидного геля в буфере трис-борат-ЭДТА (pH 8,2). Полученная картина была аналогична той, которую дает вертикальный электрофорез в крахмальном геле. В обоих случаях было выявлено несколько вариантов фенотипов. Дальнейшее уточнение фенотипов группоспецифических веществ было достигнуто с помощью перекрестного иммуноэлектрофореза [239]. Белки, разделенные путем электрофореза в полиакриламидном геле, подвергали затем электрофорезу в агарозном геле, содержавшем антитела к группоспецифическим веществам.
Церулоплазмин (система Ср). Показано, что переносящий медь гликопротеид плазмы также существует в нескольких формах, обладающих различной электрофоретической подвижностью. Вариантные фенотипы довольно часто встречаются в популяциях негроидов и очень редко у европеоидов. Шреффлер и др. [1146] применяли для определения фенотипа церулоплазмина горизонтальный электрофорез в крахмальном геле с бо-ратным буфером (pH 9,5). Образцы сыворотки в разведении 1 : 3 (по объему) подвергали электрофорезу при 4 °С и напряжении 7 В/см. Для окрашивания церулоплазмина может быть использована его оксидазная активность. Шреффлер и др. [1146] окрашивали церулоплазмин 0,1%-ным раствором о-ди-анизидина в 0,04 М ацетатном буфере (pH 5,5), содержащим 20% этанола. Фрагменты геля инкубируют в этом растворе
1 ч при 37°С. Окрашенные зоны следует немедленно фотографировать, поскольку они быстро бледнеют. После этого на том же геле можно выявить комплекс гемоглобина с гаптоглобином, используя для этой цели указанный выше красящий раствор с добавлением Н202 (см. следующий раздел).
Гаптоглобины (система Нр). Г а птоглобин — это аг-гликопротеид, функциональная роль которого состоит в том, что он связывает освобождающийся из эритроцитов гемоглобин. Уже в ранних исследованиях была обнаружена молекулярная гетерогенность гаптоглобинов (см. обзор [622]). Впервые эту гетерогенность описал в 1955 г. Смитис, выявивший при электрофорезе <в крахмальном геле три разных типа гептоглоби-на. Позднее Смитис и Уокер [1204] показали, что все три типа га'птоглобина представляют собой фенотипическое проявление двух аллельных аутосомных генов. Фенотип Нр 1
нр j-j
Нр2-1 —?Э-
ш
Нр 2-2
2-2
Крохмальныи гель, pH 8,5
Крахмальный
гель
буфе
скислым
буфером и мочевиной
&
Рис. 107. Схематическое изображение основных типов гаптоглобина, обнаруженных путем электрофореза в крахмальном геле при pH 8,5 (верхняя часть рисунка), и основных подтипов a-цепей, выявленных при электрофорезе в крахмальном геле с кислым буфером и мочевиной.
