Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Гели, обладающие выраженными свойствами молекулярного сита (крахмальные и полиакриламидные гели), позволяют повысить разрешение компонентов. Электрофоретические методы, в которых используются эти носители, играют очень важную роль в изучении генетических изменений белков плазмы, а также в структурных и биохимических исследованиях индивидуальных белков. С помощью одномерного электрофореза в полиакриламидном геле белки плазмы можно разделить на 20— 30 зон. При электрофорезе в крахмальном или однородном полиакриламидном геле (6—7%-ном) с применением обычных
слабощелочных буферных систем обнаруживают следующие фракции: ближе к аноду по отношению к альбумину располагаются две зоны, соответствующие обогащенному триптофаном преальбумину и кислому ai-гликопротеиду (орозомукоиду); арантитрипсин не отделяется от альбумина. Ближе к катоду можно различить от трех до четырех постальбуминовых зон, состоящих из различных а г, аг- и некоторых р-глобулинов, включая группоспецифические вещества крови (Gc). К зоне транс-феррина примыкает гаптоглобин (у индивидуумов с генотипом Нр 1—1). В той же зоне расположены церулоплазмин и гемо-пексин. В сыворотке людей с генотипом Нр 2—1 мономерный гаптоглобин движется к катоду быстрее, чем трансферрин тогда как полимерные формы гаптоглобина (у людей с генотипами Нр 2—1 и Нр 2—2) движутся более медленно. Зоны IgG и IgA растянуты от старта до посттрансферриновой области. <Х2-Макроглобулин образует четкую зону недалеко от старта, а липопротеиды и IgM воообще не проникают в такие гели.
Необходимо отметить, что метод электрофореза белков сыворотки в крахмальном и однородном полиакриламидном гелях имеет некоторые недостатки. Они связаны с тем, что размеры и заряд молекулы белка нередко оказывают противоположное влияние на его подвижность. Это приводит к тому, что аран-титрипсин сливается с альбумином (в средах, не обладающих свойствами молекулярного сита, он отделяется от альбумина), а церулоплазмин, гемопексин и другие важные компоненты перекрываются другими белками и не образуют четких зон [371, 716]. Высокомолекулярные а- и р-глобулины часто сливаются с широкой зоной иммуноглобулинов. Однако эти недостатки можно устранить путем использования градиентов концентрации геля. С помощью таких методов некоторые авторы доби-
лись существенного улучшения разрешения. Райт и др. [1453] применяли «прерывистый» (неоднородный) градиент концентрации геля от 3,5 до 10%. Многие из полученных фракций они идентифицировали иммунохимически или путем специфического окрашивания. Хислоп [604] применил аналогичный метод для анализа сывороточных белков нескольких видов животных. Марголис и Кенрик [820] рекомендовали проводить исследования белков плазмы человека с помощью электрофореза в непрерывном градиенте концентрации геля в диапазоне 4—24%.
Несмотря на высокую разрешающую способность, электрофорез в гелях со свойствами молекулярного сита не нашел широкого применения в повседневной клинической практике. Он более трудоемок, чем электрофорез на ацетате целлюлозы или в агарозном геле. К тому же электрофорез в крахмальном или полиакриламидном геле труднее проводить в стандартных условиях. Проблемы стандартизации условий электрофореза в полиакриламидном геле подробно обсуждаются Маурером и Алленом [841]. Разумеется, необходимо сопоставлять стоимость метода с ценностью получаемой с его помощью информации. Основная причина того, что в повседневной практике до сих пор широко используются электрофоретические методы, обладающие ограниченной разрешающей способностью, заключается в следующем: пока известна физиологическая роль лишь небольшого числа белков плазмы и те фракции, которые нельзя обнаружить простыми методами, дают мало полезной информации для диагноза. Методы электрофореза с высокой разрешающей способностью имеют исключительно важное значение в исследованиях белков плазмы, и после установления природы и физиологической роли остальных белковых компонентов эти методы, несомненно, займут свое место в клинической практике.
Дальнейшее повышение разрешения обеспечивает двухмерный электрофорез. Описано множество различных комбинаций, таких, например, как электрофорез на фильтровальной бумаге в первом направлении и электрофорез в крахмальном геле — во втором [1031]; электрофорез на ацетате целлюлозы в первом направлении и ИЭФ — во втором [944]; ИЭФ на первом этапе и электрофорез в полиакриламидном геле — на втором [270, 1127]. Самые лучшие результаты получают при использовании на первом этапе электрофореза в мягких полиакриламидных гелях или ИЭФ, а на втором — электрофореза в градиенте концентрации полиакриламидного геля. Таким путем Райт [1452] изучал белковый состав нормальных сывороток и сывороток больных с некоторыми видами злокачественных опухолей (рис. 103). Основные классы иммуноглобулинов давали при этом дискретные зоны. Постальбуминовая зона разделялась
более чем на 20 компонентов; очень большое число белков было обнаружено в преальбуминовой зоне. Райт [1452] отмечает, что при некоторых заболеваниях наблюдаются изменения минорных компонентов, которые не выявляются обычными методами одномерного электрофореза, поэтому желательно проводить сравнение нормальных и патологических сывороток при максимальном разрешении. Такие исследования особенно полезны при изучении белков, значение которых в физиологии и патологии еще неизвестно.
