Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ния картины разделения данного белка с электрофореграмма-ми известных фенотипов трансферрина.
Наиболее часто для определения фенотипа трансферрина используют электрофорез в крахмальном геле. Разделение проводят в боратном буфере Смитиса [1199] или в неоднородной трис-цитратной системе Паулика [1028]. Для установления фенотипа трансферринов животных применяют и другие буферные системы, в частности систему Аштона и Брейдена [65]* Спунер и Бакстер [1221] использовали буфер трис-какодиловая кислота (pH 7,45). Кроме того, с этой целью проводят электрофорез в полиакриламидном геле в трис-глициновом буфере при pH 8,8 [960] или при pH 9,3 [1275]. Наличие в сыворотке человека того или иного вариантного трансферрина обнаруживают также с помощью электрофореза в агаровом геле [630], а для подтверждения полученных результатов осуществляют во втором направлении иммуноэлектрофорез [424]. Однако в этом случае картина оказывается менее четкой, чем при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле. В последнее время стали применять другой подход: вначале сыворотку подвергают изоэлектрофокусированию в геле из специальной марки агарозы (лишенной электроэндосмоса), а затем проводят электрофорез в геле, содержащем антитела [492, 631].
Зоны трансферрина выявляют путем насыщения сыворотки перед электрофорезом ионами 59Fe3+ и радиоавтографии полученных электрофореграмм. По методу Гиблетта и др. [433] перед электрофорезом к 1 мл сыворотки добавляют 5 мкКи 59FeCl3. После электрофореза крахмальные гели разрезают на отдельные фрагменты, которые завертывают в прозрачный материал, помещают на подходящую рентгеновскую пленку и экспонируют в течение 12 ч. При более длительной экспозиции для предотвращения диффузии необходимо замораживать гель и проводить радиоавтографию при глубоком охлаждении.
Мюллер и др. [887] описали другой метод обнаружения трансферрина. Они предлагают проводить окрашивание этих белков солью нитрозо-iR — чувствительным индикатором на железо. Еще один метод состоит в осаждении большинства белков сыворотки риванолом. При таком осаждении в надосадоч-ной жидкости остаются трансферрин и IgG. Определение фенотипа можно осуществлять путем простого окрашивания электрофореграмм белковыми красителями, поскольку IgG не мешает идентификации трансферрина [836].
У человека обнаружено множество фенотипов транферрина, и все они контролируются аутосомными кодоминантными генами. При электрофорезе гетерозиготный фенотип выявляется в виде двух зон, а гомозиготный — в виде одной. Наиболее часто встречается фенотип TfC, соответствующий гомозиготному
генотипу Tfc/Tfc. Все остальные варианты отличаются очень низкой частотой встречаемости. У некоторых видов животных выявлена более сложная картина. У крупного рогатого скота каждый из аллелей трансферрина обнаруживается в виде четырех основных полос, впереди которых расположены еще две слабые полосы [1221]. Разные варианты имеют неодинаковые наборы полос. Электрофоретическую гетерогенность внутри одного варианта приписывают различному содержанию нейрами-новой кислоты [223, 1221]. Присоединение к трансферрину нейраминовой кислоты контролируется отдельным генным ло-кусом. Обнаружены также варианты, различающиеся по числу остатков нейраминовой кислоты [1221]. Такой вид вариабельности не зависит от основных вариаций фенотипа, контролируемых структурным локусом, кодирующим полипептидную цепь трансферрина [1238]. При электрофорезе трансферринов из сывороток новорожденных младенцев [973] и плодов крупного рогатого скота [1222] получается картина, отличающаяся от той, которую дают трансферрины из сывороток взрослых людей и животных. Эти различия тоже связаны с разным содержанием нейраминовой кислоты. В белке птичьих яиц обнаружен белок, связывающий железо (овотрансферрин, ранее называвшийся кональбумином). Он отличается от сывороточного трансферрина только по составу углеводной части [1426]. Для овотранс-феррина характерна та же наследственная вариабельность, что и для трансферрина сыворотки. У одной и той же особи электрофоретические зоны овотрансферрина в обычных экспериментальных условиях располагаются дальше от анода, чем зоны сывороточного трансферрина [83, 375].
Pic-Глобулин (система СЗ). (З^-Глобулин идентичен фактору 3 системы комплемента (СЗ). Впервые варианты этого белка обнаружил Виме [1419] с помощью электрофореза в агаровом геле. В дальнейших исследованиях был установлен генетически детерминированный полиморфизм pic-глобулина. Можно различить два обычных варианта C3S и C3F и более 20 редких вариантов [1101]. Все формы р^-глобулина контролируются аутосомными кодоминантными аллелями [31, 75, 1284]. Для разделения фенотипов СЗ применяют электрофорез в агарозном геле при средней величине напряжения [31] или высоковольтный электрофорез в крахмальном геле [75]. Методика электрофореза в агарозном геле была модифицирована с тем, чтобы уменьшить подвижности СЗ и таким образом отделить его от других белков, присутствующих в области (3-глобулинов (рис. 109). С этой целью была снижена ионная сила буферного раствора и увеличена напряженность электрического поля» а кроме того, в буфер были включены ионы Са2+. В настоящее время такую методику применяют в основном в модификации
