Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
J 2 6,74 0,007
N 3 6,64 0,012
Рис. 99. Разделение цепей гемоглобина на полосках целлогеля при pH 8,0 в присутствии 6 М мочевины [774]. Видно, что в гемоглобине G Вейманало аномалия локализована в a-цепи, а в гемоглобине G Си-Цзу (Hsi-Tsou) —
в р-цепи.
глобина, которые в недиссоциированном виде не отличаются по подвижности от нормального гемоглобина [1142]. Глобин можно получить по классической методике Ансона и Мирского [43], в которой для осаждения глобина и отделения гема используется охлажденный ацетон. Для диссоциации полипептидных цепей глобина применяют 6 М мочевину, а для поддержания реактивных SH-групп в восстановленной форме добавляют мер-каптоэтанол [224]. В более ранних работах применяли электрофорез в гелях. Чернов и Петтит [224] использовали вертикальный электрофорез в крахмальном геле и проводили разделение в вероналовом буфере (pH 8,0), содержавшем 8 М мочевину. Гаррик и др. [429] нашли, что лучше использовать буферную систему трис~борат-ЭДТА. Они рассмотрели возможные причины появления на электрофореграммах «теневых зон» и подчеркнули необходимость применения деионизированной мочевины. Методика была значительно упрощена благодаря использованию в качестве поддерживающей среды пленок из ацетата целлюлозы [698, 774, 1320]. Коне и др. [698] применяли буферную систему трис-борат-фосфат-ЭДТА (pH 6,8), к которой была добавлена мочевина в конечной концентрации 8 М. Электродный буфер содержал фосфат в той же концентрации, что и буфер для пропитывания пленок. Лю [774] проводил разделение на желатинизированном ацетате целлюлозы в буферной системе трис-борат-ЭДТА, содержавшей 6 М мочевину
НЬ
А
Нормальные I гемоглобины S F
1Л
Замещения в а-цепц
Замещения в р-цепи
Хаширон
^ладепьфия
„Форт-Уэрт
^Лос-Анджелес - Кушатта .Гальвес тон
Вулеич
К
j Балтимор ц Балтимор
Замещения г , в (Г-цепи ^ \
Структура или замещение
cc2jiz
az72
«А
ос/6 iys-*-gly a 47 asp ->his Oi ЬЬ asn-* tys a 27 glu-g!y
(126 glu -* lys
p>l2fgtu+lys (i6glu^lys ji6glu-*!/ai fil21gtu+ gin p>22glu + alQ jhb3gtu + ala p 1)7 his -arg (ll3Zlys-*gLn fiiSgly -asp (h 95 lys + glu
5l6gly-*- arg
pH 3,8
II
I I
I l
pH 6.0-6.5
I С
I I
Puc. 100. Схематическое) изображение подвижностей различных цепей глобина при электрофорезе на ацетате целлюлозы в двух буферах с разными значениями pH, содержащих мочевину и 2-меркаптоэтанол [1142].
(рис. 99). В обеих указанных работах [698, 774] применяли микромодификацию метода электрофореза на ацетате целлюлозы. Шнейдер [1142] опубликовал подробное исследование по электрофорезу глобиновых цепей в щелочной (pH 8,6—8,9) и слабокислой (pH 6,0—6,5) буферных системах (рис. 100). Исследователи, применяющие электрофорез на ацетате целлюлозы, обычно не проводят выделения глобина, а наносят на пленки, пропитанные буферным раствором с мочевиной, гемолизаты, обработанные меркаптоэтанолом.
Стегинк и др. [1231] разработали еще одну электрофоретическую методику для разделения цепей глобина. Эти авторы модифицировали предложенный ранее [963] метод электрофореза в полиакриламидном геле в системе мочевина — уксусная кислота.
Для диссоциации цепей глобина вместо денатурации в растворе мочевины можно использовать реакцию гемоглобина с н-хлормеркурибензоатом. После того как все доступные SH-группы прореагируют с я-хлормеркурибензоатом, молекула гемоглобина распадается на составляющие ее полипептидные цепи [176]. Этот процесс можно контролировать с помощью электрофореза в крахмальном геле [1113]. В работе Бунна [181] приведен пример обнаружения аномальной p-цепи гемоглобина при ИЭФ в полиакриламидном геле цепей глобина, разделенных с помощью /г-хлормеркурибензоата. В одной из более поздних работ [447] получены доказательства образования не только мономерных цепей глобина, но и промежуточных продуктов, в частности димеров р- и а,р~цепей. К такому заключению авторы пришли на основании данных электрофореза в полиакриламидных гелях различной концентрации и анализа этих данных с помощью графика Фергюсона.
11.7.5. Электрофоретическая картина белков плазмы крови
Плазма крови содержит сложную смесь большого числа различных белков. Исследование этих белков невозможно без применения тех или иных методов разделения. Наиболее широко для этой цели применяется электрофорез, позволяющий получать качественную и количественную информацию о составе белков в образцах сыворотки или плазмы крови.
Методом электрофореза с подвижной границей при использовании, как правило, буферных растворов с pH 8,4—8,6 белки плазмы можно разделить на 5 или 6 фракций: альбумин и несколько групп глобулинов, обозначаемых каксц-,а2-, Р и у-гло-булины. С помощью данного метода на ранних этапах его развития были установлены многие важные свойства белков плазмы. Результаты этих исследований были суммированы в ряде обзоров [560, 1149, 1462]. Электрофорез с подвижной границей применялся также для проверки чистоты белков, получаемых в препаративных количествах для клинических целей. И до сих пор этот метод используется для тестирования выделенных из плазмы белковых фракций (следует сказать, что для контроля качества необходимы также и другие методы, такие, как ультрацентрифугирование или иммунохимический анализ). Так, например, согласно существующим стандартам (Комитет экспертов по биологической стандартизации при Всемирной организации здравоохранения, 1967), препараты иммуноглобулинов человека должны содержать не менее 90% глобулинов с электрофоретической подвижностью, не превышающей —2,8* 10“5 см2/В
