Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Тейзберга [1284]. Электрофорез проводят в слое 1%-ного агарозного геля толщиной 1,24 мм 'С вероналовым буфером (pH 8,6; (1 = 0,025), содержащим 0,9 мМ лактат кальция. Напряженность электрического поля составляет 20 В/см? поэтому необходима зффек* тивная система охлаждения. Электродные резервуары заполняют вероналовым буфером (pH 8,6; |л = 0,065), содержащим 1,8 мМ лактат кальция. На пластину геля размером 20X20 см можно наносить 10—15 образцов (5 мкл сыворотки). Варианты СЗ обозначают в соответствии с их подвижностью в 'агарозном геле [30], С этой целью изме-_ f/ln _ ряют расстояние между ана-
вариан,ты Р1С'ГЛ°- лизируемой зоной и зоной ва-оулина (СЗ), выявляемые методом е> / ,=¦
электрофореза в агарозном геле по рианта S (наиболее часто Тейзбергу [1284]. Образцы 330 и 332 встречаемого типа). Единицей получены от гетерозиготных (C3SF), измерения служит расстояние “бразец 331 —от гомозиготного межДу зонами вариантов S И (C3S) и 333 — от гомозиготного ,,, . .
(C3F) индивидуумов. ГС любезного которому В модифициро-
разрешения д-ра G. Fust и Maria ванной системе [30] соответ-Csecsi-Nady (Будапешт).] ствует расстояние между зо-
нами вариантов S и S1. Варианты, мигрирующие быстрее, чем C3S, обозначают буквой F и цифрой, показывающей относительную 'подвижность, определя-ему по описанному выше принципу. Аналогичным образом варианты, обладающие меньшей подвижностью по сравнению с C3S, обозначают буквой S с цифрой, показьгващей относительную подвижность [30]. Адекватная идентификация фенотипа СЗ не может быть основана на сравнении с подвижностью другого белка (например, трамсферрина), так как подвижность вариантов СЗ зависит от концентрации Са2+ [28].
Азен и Смитис [75] предложили другой подход. Они проводили электрофорез на вертикальных пластинах крахмального геля в буфере трис-НС1 (pH 8,9), содержавшем 2 мМ MgCl2 при напряжении 16 В/см [75]. Оба метода давали в основном сравнимые результаты [32].
В процеосе хранения белок СЗ подвергается разрушению и превращается в более быстро мигрирующую форму, называемую СЗс ({И А). При хранении сыворотки при +20 °С зоны на участке СЗ исчезают за 5—7 дней, тогда как при — 70 °С электрофоретическая подвижность белка СЗ не изменяется по крайней мере в течение 7 мес [1284].
По данным электрофореза в крахмальном геле для белка СЗс также характерен полиморфизм [431]. Этот белок представлен зонами, локализованными в посттрансферри-повой области. Показано, что главные фенотипы СЗ можно идентифицировать и в виде СЗс, но в случае редких вариантов СЗ этого сделать не удается [1101].
Обогащенный глицином р-гликопротеид (система Bf, ранее обозначавшаяся Gf). Этот белок идентичен фактору В (проактиватор компонента СЗ) пропердинового пути активации комллемента. Альпер и др. [29] обнаружили генетический полиморфизм обогащенного глицином гликопротеида, иопольауя для этой цели электрофорез в агарозном геле по Лореллу и Нилену [744] или в модификации автора, (введенной для анализа вариантов СЗ [31]. Полосы гликопротеидов выявляют путем иммунофиксации их специфической антисывороткой или с помощью иммуноэлектрофореза. Два обычных варианта гликопротеида BfF и BfS представлены по крайней мере четырьмя зонами (рис. 110, / и III). На злектрофореграмме белка медленного подтипа BfS (/) присутствуют все зоны (за исключением самой быстрой), характерные для белка быстрого подтипа (III), и наоборот. В белке с гетерозиготным фенотипом (II) обнаруживаются все четыре зоны, характерные для BfF и BfS. Обнаружены также два редких варианта BfFi и BfS,. При активации фактора В происходит его протеолиз, в
» II ill
Рис. 110. Генетически детерминированные варианты обогащенного глицином p-гликопротеида (В-фактора)» выявляемые с помощью электрофореза в агарозном геле при pH 8,6 и последующей иммунофиксации специфической антисывороткой [29]. I — тип SS; II — тип FS; III — тип FF.
результате чего он превращается в обогащенные глицином у-и а-гликопротеиды. Обнаружено, что а-гликопротеиды обладает электрофоретическими характеристиками BfF и BfS, тогда как Y-гликопротеиды проявляют свойства, присущие BfFi и BfSi [29]. Структурные детерминанты для обычных и редких .вариантов локализованы, по-види-мому, в разных участках белковой молекулы.
11.7.7. Липопротеиды плазмы крови
Белки плазмы крови, транспортирующие липиды, играют очень важную роль в физиологии и патологии организмов. Эти белки классифицируют либо по плавучей плотности (путем ультра-центрифугирования), либо по электрофоретической подвижности. Согласно первому критерию, различают хиломикроны, а также липопротеиды с очень низкой (ЛОНП), липопротеиды с низкой (ЛНП) и липопротеиды с высокой (ЛВП) плотностями. При электрофорезе с подвижной границей хиломикроны и ЛОНП мигрируют во фракции а2-глобулинов, ЛНП — во фракции Pi-глобулинов, а ЛВП — во фракции агглобулинов. При электрофорезе в блоках гранулированного картофельного крахмала липопротеиды обладают такой же подвижностью, как и при электрофорезе с подвижной границей [729]. Этот метод очень полезен для микропрепаративного разделения липопро-теидов. Кроме того, он служит аналитическим инструментом в специальных исследованиях. Для серийных определений липо-протеидного состава плазмы используют модификации электрофоретических методов, применяемых при анализе белков плазмы (электрофорез на бумаге, ацетате целлюлозы, в агарозном или полиакриламидном гелях; рис. 111). Липопротеиды можно выявлять либо с помощью специфических липофильных красителей, либо путем специфического осаждения. Чтобы приспо-. собить методы электрофореза белков плазмы для оптимального разделения липопротеидов, необходимо не только изменить способ окрашивания, но и подобрать состав буфера, концентрацию геля и электрические параметры. Для электрофореза липопротеидов лучше всего использовать свежую плазму, содержащую в качестве антикоагулянта ЭДТА [97], но можно также применять сыворотку или плазму, в которую добавлен любой другой антикоагулянт, за исключением гепарина. Образцы хорошо сохраняются в холодильнике в течение нескольких дней. После 28 дней хранения образцов при температуре холодильника Винкельман и др. [1436] не обнаружили существенных изменений в поведении липопротеидов при электрофорезе на ацетате целлюлозы. Липопротеиды опасно -подвергать замораживанию, однако после однократного замораживания и оттаивания
