Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
и определяемой методом электрофореза с подвижной границей в стандартных условиях.
Как отмечает Лорелл [743], «в конце 50-х годов в клинических лабораториях распространилось, как эпидемия, использование простого в техническом отношении метода электрофореза на бумаге». Картины разделения белков, полученные двумя методами: электрофорезом на бумаге и электрофорезом с подвижной границей, были в общих чертах сходны между собой; различия были обусловлены тем, что бумага не является абсолютно инертным носителем и может адсорбировать некоторые компоненты (например, липопротеиды или альбумин) [752, 1469]. При электрофорезе в обычно применяемых вероналовых буферах с pH 8,4—8,6 в сыворотке удается различить 5 указанных выше обычных компонентов, а в плазме обнаруживается, кроме того, еще и фибриноген. При включении в буфер ионов Са2^ подвижность одного из компонентов р-глобулпновой фракции (компонента Pic — компонента Сз системы комплемента) снижается, вследствие чего зона р-глобулинов распадается на Рг и р2~глобулины. Значительно более высокое разрешение можно получить в буферной системе трис-борат-ЭДТА [54], од-ьако она не получила широкого применения. Белковые фракции выявляют путем окрашивания, но при их количественной оценке возникают серьезные трудности, связанные с тем, что относительные количества фракций, полученных из плазмы методом электрофореза с подвижной границей и методом электрофореза на бумаге или на других носителях, существенно различаются, Различия обусловлены разными принципами количественного определения: в первом случае измеряется увеличение преломления света, а во втором — связывание красителя. Для устранения этих различий предлагалось использовать поправочные коэффициенты. Наиболее важной причиной отклонений является то, что альбумин связывает краситель сильнее, чем большинство других фракций. Количественной оценке электрофореграмм стали придавать меньше значения после того, как комиссия авторитетных специалистов [743] пришла к выводу, что наилучшим способом оценки электрофореграмм является визуальный метод. Количество отдельных белков можно точно определить иммунохимическими методами. Вопросы методики и применения электрофореза на бумаге подробно обсуждаются в ряде обзоров [133].
В настоящее время при разделении белков плазмы на основные фракции альбуминов и глобулинов метод электрофореза на фильтровальной бумаге заменяется электрофорезом на ацетате целлюлозы или в агарозных гелях (рис. 101). (Лучше использовать агарозу, а не агар, поскольку сильно заряженный агаропектиновый компонент взаимодействует с рядом белков и
Рис. 101. Разделение сыворотки крови человека с помощью электрофореза в геле агарозы и кривые, полученные при денситометрическом измерении электро-фореграмм. Нормальная сыворотка (Л) и сыворотки больных с множественной миеломой (5), циррозом печени (В) и нефротическим синдромом (Г).
[С любезного разрешения д-ра J. Jako (Будапешт).]
приводит к очень высокому электроэндосомотическому току жидкости.) В одной из своих работ Лорелл [742] обсуждает вклад индивидуальных белков плазмы крови человека в общую электрофоретическую картину (рис. 102). К основным белковым компонентам плазмы относятся сывороточный альбумин: ai-липопротеид, кислый ai-гликопротеид (орозомукоид) и сц-антитрипсин (сывороточный ингибитор трипсина), расположенный на электрофореграмме в зоне ai; аг-макроглобулин и гаптоглобин (зона аг), а также гемопексин, трансферрин, р-ли-попротеиды и компонент СЗ (зона р). Для иммуноглобулинов
! f :|КГ J 1.2 $г *:
I .
Рис. 102. Положение основных белков плазмы крови человека при электрофорезе в агарозном геле [742]. Лп — липопротеид; Ат — антитрипсин; М — мак-роглобулин; Тф — трансферрин; Ф — фибриноген; Ор — орозомукоид; Нр — гаптоглобин; Гкс — гемопексин; СЗ — компонент комплемента.
характерно диффузное распределение в широком интервале между зонами аг- и 7-глобулинов. Фибриноген локализуется между зонами р- и углобулинов. В плазме крови присутствует также множество других компонентов, но обычно они не влияют на количественное распределение основных электрофоретических фракций, разделяемых при одномерном электрофорезе на ацетате целлюлозы или в агарозном геле. Такие минорные компоненты (их концентрация не превышает 0,5 мг/мл) можно выявить более сложными методами электрофореза или с помощью специфических (чаще всего иммунохимических) тестов. Для количественного определения одного из главных компонентов применяют какой-либо специфический метод, но изменения в содержании таких компонентов отражаются и на общей картине разделения, получаемой при использовании обычных электрофоретических методов, которые до сих пор считаются вполне адекватными методами проведения массовых анализов [743]. Более того, электрофорез позволяет выявить мо-но-, олиго- или поликлональную природу компонентов иммуно-
глобулинов. Такую информацию нельзя получить путем количественного определения содержания иммуноглобулинов. Поэтому наиболее важное требование, предъявляемое к электрофорезу белков плазмы, заключается в том, что он должен обеспечивать надежную дифференциацию между моно-, олиго- и поликлональными иммуноглобулинами [743].
