Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Холодильник
Для хранения сред, реактивов и тканей может служить небольшой бытовой холодильник, имеющий камеру для замораживания.
Специальные газовые баллоны
При культивировании клеток 5%-ное содержание С02 в воздухе поддерживается с помощью калиброванного баллона с вентилем, обеспечивающим строго контролируемую подачу. Г аз поступает преимущественно
под бактериологический колпак на рабочем столе. Запасной баллон служит для заполнения основного баллона.
Инвертированный микроскоп
Для периодической проверки роста клеток в сосудах пользуются инвертированным микроскопом, который позволяет исследовать клеточный слой снизу, не переворачивая его. Сосуд с культурой помещают на подвижный столик, расположенный над револьверной головкой микроскопа с объективами; источник света и конденсор находятся над сосудом. Prior Mark II Inverted Microscope (W. R. Prior and Co. Ltd., Bishop's Stortford, Herts) позволяет исследовать клетки, растущие в различных сосудах: от узких флаконов Карреля до матрасов глубиной 77 мм.
Центрифуги
Два типа центрифуг, имеющих крестовину на 6 стаканов по 20 мл и на 4 стакана по 60 мл, вполне удовлетворят потребности лаборатории.
ПОДГОТОВКА СТЕКЛЯННОЙ ПОСУДЫ
Вся стеклянная посуда, применяемая при культивировании фибробластов, требует специальной обработки, поэтому ее следует мыть отдельно от другой лабораторной посуды, особенно если возможно загрязнение сили-конизирующими жидкостями или сильными детергентами. Жиры и токсические вещества на поверхности стекла препятствуют прикреплению фибробластов для образования монослоя. Плохо вымытая посуда — одна из основных причин слабой пролиферации фибробластов в первичной культуре или в последующих пересевах; поэтому крайне важно тщательно следить за чистотой сосудов, в которых выращивают фибробласты.
Необходимая стеклянная посуда
Флаконы Карреля, 45ХЮ мм.
Гексагональные «рожки» из Пирекса объемом 125 мл.
Плоские матрасы объемом 100 мл.
Универсальные узкогорлые контейнеры.
Маленькие бутылочки.
Конические центрифужные пробирки.
Чашки Петри диаметром 6 см.
Пастеровские пипетки.
Градуированные пипетки.
Мытье посуды Растворы
Концентрированный раствор метасиликата натрия (360+40 г кальгона, растворенных в 4 л воды)
1 н. НС1.
Стандартный Stergene (детергент).
Метод
Новую и использованную стеклянную посуду замачивают на ночь в растворе метасиликата натрия, разбавлен-ленном в 100 раз водой, промывают водопроводной водой и нейтрализуют 1 ч в 0,01 н. НС1. Обработанную посуду погружают в горячий детергент—10 мл Stergene в 5 л горячей водопроводной воды. На этой стадии внутреннюю поверхность сосудов очищают ершиком, а пипетки промывают горячим раствором детергента, пропуская детергент через пипетку несколько раз. Споласкивают 3 раза проточной горячей водопроводной водой, затем дистиллированной водой, которую меняют трижды, и окончательно ополаскивают деионизованной водой. Колпачки от бутылок, силиконовые резиновые прокладки и пробки обрабатывают .сходным образом. После высушивания посуда стерилизуется.
РАСТВОРЫ И КОМПОНЕНТЫ РОСТОВЫХ СРЕД
Стерильные растворы
Раствор Олсвера
Цитрат натрия — 8 г.
Хлористый натрий — 4,2 г.
Глюкоза — 20,5 г.
10%-ный раствор лимонной кислоты — 8 мл.
Деионизованная вода — до 1 л.
Стерилизуют автоклавированием. Разливают по
3 мл в универсальные контейнеры.
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса
К готовому раствору (Oxoid Division of Охо Ltd., Southwark Bridge Road, London S. E. 1) добавляют 1,4%-ный раствор NaHC03 (вес/объем), pH которого доведен до 7,0 с помощью СО2; индикатором служит феноловый красный.
Раствор трипсина
Трипсин (Difco 1:250) [Baird and Tatlock (London), Ltd., Freshwater Road, Chadwell Heath, Essex]—1 r.
Раствор Хэнкса— 100 мл.
Стерилизуют фильтрацией. Сначала из фильтра удаляют примеси, пропуская через систему деионизованную воду. При употреблении 1 мл запасного раствора трипсина разбавляют в 20 мл раствора Хэнкса.
Раствор колхицина
Колхицин C22H25NO6 (В. D. Н. Chemicals Ltd., Poole, Dorset)—1 мг/мл.
Перед употреблением разбавить до концентрации 0,01 мг/мл раствором Хэнкса. Запасной раствор надо готовить раз в месяц, а разбавленный рабочий раствор приготавливают в день использования. Если запасной раствор предполагают хранить более недели, то его стерилизуют фильтрацией, однако небольшие количества, которые готовят еженедельно и хранят в холодильнике, можно не стерилизовать.
Человеческая плазма для получения плазменных сгустков
5 мл свежей цельной крови добавляют к 3 мл раствора Олсвера, осторожно перемешивают и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин (до тех пор, пока
смесь плазма — антикоагулянт не станет прозрачной). Плазму, кроме нижнего слоя, отделяют и разливают по 1 мл в маленькие бутылочки. По возможности пользу* ются свежей плазмой, но удовлетворительные сгустки получаются при хранении ее до недели при 4°С.
