Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Для инициации образования сгустка добавляют 0,15 мл 2%-ного хлористого кальция в деионизованной воде к 1 мл плазмы.
КОМПОНЕНТЫ РОСТОВЫХ СРЕД
Основная среда для культивирования тканей
Среда 199 (Morgan, Morton and Parker's medium № 199, 1950), содержащая 200 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Wellcome Reagents Ltd., Wellcome Research Laboratories, Beckenham, BR3 3BS).
Куриный эмбриональный экстракт
Лучше готовить экстракт в лаборатории из десятидневных куриных эмбрионов, а не пользоваться поступающим в продажу. Простой и надежный метод приготовления предложен Полом [8]. Необходимо следить, чтобы поступающие оплодотворенные яйца были хорошего качества; из некоторых партий получается мутный экстракт, причем осадок не удаляется фильтрованием. При добавлении таких экстрактов в ростовую среду на поверхности стекла образуется пленка, которая неблагоприятно сказывается на прикреплении фибробластов. Куриный эмбриональный экстракт (по 20 мл) хранят при глубоком замораживании. Перед употреблением его размораживают и центрифугируют для удаления тонкого осадка, количество которого увеличивается при длительном хранении.
Куриный эмбриональный экстракт можно использовать в течение 6 мес после приготовления, но наиболее удовлетворительные результаты получаются при хранении менее месяца.
Сыворотка
Сыворотку, полученную из крови одного донора с группой крови АВ, стерилизуют фильтрованием. Опалес-цирующая сыворотка, содержащая макроскопические липидные частицы, непригодна. Токсичную сыворотку, повреждающую ядро и цитоплазму, а также вызывающую хромосомные изменения, употреблять не следует. Каждый новый источник сыворотки проверяется на культурах контрольных активно размножающихся фибробластов. Для того чтобы свести до минимума эффект токсической сыворотки, рекомендуют смешивать сыворотку от разных доноров. Однако даже смешанная сыворотка может все же существенно снижать рост фибробластов, если в ней содержится сыворотка, обладающая сильным токсическим действием. Контроль каждой партии сыворотки как от одного донора, так и от группы доноров представляет собой крайне важную меру предосторожности.
При отсутствии крови группы АВ можно пользоваться сыворотками, полученными из крови других групп системы АВО. Если нет человеческой сыворотки, можно временно брать телячью или свиную сыворотку, но скорость роста фибробластов при этом сильно уменьшается.
РОСТОВЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ПЕРВИЧНЫХ И ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР
Среда А
Используется для всех первичных культур.
Среда 199 с антибиотиками — 12 мл.
Сыворотка крови группы АВ — 4 мл.
Куриный эмбриональный экстракт— 4 мл.
Среда Б
Используется для пересевов, которые необходимы для приготовления хромосомных препаратов.
Среда 199 с антибиотиками — 14 мл.
Сыворотка крови группы АВ — 4 мл.
Куриный эмбриональный экстракт— 2мл.
Среда В
Основная поддерживающая среда, в которой хранятся запасные культуры и осуществляются контрольные пересевы.
Среда 199 с антибиотиками — 16 мл.
Сыворотка крови группы АВ — 4 мл.
КОЖА И ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ ФИБРОБЛАСТОВ
КОЖА
Небольшой кусочек кожи, необходимый для получения культуры фибробластов, легко получить, не причиняя вреда больному, с внутренней поверхности предплечья (у взрослых) или с внутренней поверхности бедра (у детей). Некоторые исследователи предпочитают применять местную анестезию, например, 1%-ным прокаином [9], однако инъекций токсичного вещества вблизи источника клеток лучше избегать. Метод, предложенный Эдвардсом [10], относительно безболезнен в опытных руках, не оставляет постоянного шрама, и кровопотери при этом минимальны.
Выбранный участок кожи очищают 70%-ным спиртом. После того как спирт испарится, участок кожи 6— 8 мм длиной и 1—2 мм шириной зажимают заостренным стерильным пинцетом (длиной 11 см) с гладкими концами. Зажатая кожа должна возвышаться над краем пинцета на высоту 1 мм параллельно поверхности кожи бедра или предплечья. В таком положении кожу держат примерно 30 с до тех пор, пока она не станет белой и анемичной. Стерильным хирургическим лезвием проводят вдоль пинцета, и биопсийный материал помещают в маленькие бутылочки со средой 199. Появление небольшого количества крови после снятия пинцета указывает на то, что биопсия достаточно глубокая и захватила слой собственно кожи. Небольшая ранка заклеивается пластырем, который можно удалить через несколько дней.
ДРУГИЕ ИСТОЧНИКИ
Известно, что в случаях с аномалиями половых хромосом нередко прибегают к хирургическому вмешательству для идентификации первичных гонад. Взятый при этом материал первичных гонад, а также материал в какой-то мере дифференцированных яичников и семенников может служить источником фибробластов. Кусочки органов помещают в среду 199, причем необходимо избегать попадания в среду формалина или других фиксаторов, которые используются при фиксации биопсийного материала для гистологического исследования. Особенно широкораюпросираненньим источником фибробластов служит материал, полученный при пункционной биопсии, или кусочки тканей семенника, взятые при хирургическом вмешательстве, к которому часто прибегают в случае синдрома Клайнфельтера (XXY). Крошечный кусочек ткани — вот все, что требуется в этом случае для получения культуры фибробластов.
