Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фридлянской И.И. -> "Новые методы культуры животных тканей" -> 67

Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.

Фридлянской И.И., Олева Ю.В. Новые методы культуры животных тканей — М.: Мир, 1976. — 255 c.
Скачать (прямая ссылка): noviemetodikulturi1976.djvu
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 80 >> Следующая

Как правило, из одной 'биопсии получают две первичные культуры, в каждой из которых содержится примерно по 6 эксплантатов. Кусочки кожи по отдельности переносят в другую чашку Петри в небольшую каплю плазмы крови человека с антикоагулянтом и встряхивают, чтобы удалить остатки среды 199. Маленькие кусочки удобнее переносить из одного сосуда в другой с помощью пастеровской пипетки, имеющей небольшое сужение около кончика, которое препятствует попаданию кусочка в основную часть пипетки. С поверхности эксплантата удаляют большую часть плазмы и по возможности сухие кусочки переносят в два флакона Карреля. Затем к 1 мл плазмы человека добавляют 0,15 мл стерильного раствора 2%-ного СаСЬ и тщательно перемешивают. Тонкой пастеровской пипеткой поверх каждого эксплантата наносят небольшую каплю этой смеси, затем ее отсасывают и заменяют свежей (кусочек ткани должен быть полностью покрыт плазмой, а не плавать на поверхности). Размер капли подбирается так, чтобы кусочек ткани мог прикрепиться к поверхности стекла в сгустке и вместе с тем чтобы капля не была слишком большой. Сгусток образуется примерно через 5 мин, хотя это время варьирует для разных доноров и зависит от срока взятия крови. Однако даже при небольшом опыте этого времени вполне достаточно для завершения операции. Флаконы Карреля, заткнутые ватными пробками, помещают в термостат по крайней мере на 30 мин для образования плотного сгустка, затем осторожно добавляют 2 мл среды А, а воздух насыщают 5% СОг. Ватную \пробку заменяют резиновой.
Иногда из-за неточно выполненных процедур некоторые или даже все эксплантаты могут открепиться в течение нескольких часов. В таких случаях рекомендуется удалить открепившиеся кусочки, ополоснуть их в свежей плазме и снова заключить в плазму в новом флаконе Карреля.
ОБРАБОТКА МОНОСЛОЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТАФАЗНЫХ ПЛАСТИНОК
ПЕРЕСЕВ КЛЕТОК
После выхода фибробластов из эксплантата клетки начинают быстро размножаться. Примерно через 5—10 дней в зависимости от количества пролиферирующих эксплантатов при микроскопическом исследовании в культуре различим слой фибробластов, покрывающий около 7з—7г всей поверхности дна флакона Карреля. На этой стадии клетки пересевают в большие по размерам флаконы Карреля.
Культуральную среду в исходном флаконе Карреля заменяют слабым изотоническим раствором трипсина. В результате мягкого воздействия трипсина фибробла-сты приобретают сферическую форму и открепляются от стекла. Примерно через 10 мин действия трипсина (при 37 °С) полученную суспензию клеток переносят в стерильную закрытую коническую пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок клеток ресуспендируют в 5 мл среды Б и переливают в сосуд для культивирования. Газовую фазу заменяют на смесь воздуха с 5% С02, как и в случае первичной культуры, и клетки помещают в термостат при 37 °С. В течение 2—3 ч клетки оседают, прикрепляются к поверхности стекла и распластываются, а затем начинают размножаться. Ростовую среду обычно меняют 3 раза в неделю.
Наиболее удобны для культивирования детские «рожки» из стекла пирекс, закрытые резиновыми пробками. Количество метафаз, которое получают при обработке монослоя фибробластов на одной из плоских поверхностей такого рожка, достаточно для хромосомного
Р'ие. 7.1. Монослой, образованный фи-бробластами при их субкультивировании.
Среди обычных веретеновидных видны округлившиеся клетки, наличие которых свидетельствует о высоком митотическом индексе.
анализа. После того как клетки первой субкультуры или первого пассажа сформируют монослой, их либо обрабатывают антимитотическим агентом для накопления метафаз и готовят (препараты хромосом, либо трипси-низируют и из суспензии клеток получают культуры второго пассажа в отношении 1:2 или более (рис. 7.1). Таким образом, если препараты хромосом окажутся не-
удовлетворительными, можно использовать клетки последующих пассажей для пересева и повторного анализа хромосом.
В исходных первичных трипеинизированных культурах в большинстве случаев вновь наблюдается рост фибробластов, если во флаконы Карреля добавить свежую культуральную среду и повторно инкубировать. Это может оказаться чрезвычайно важным в том случае, если не удалось получить успешной субкультуры.
Оптимальные условия для образования монослоя
фибробластов
Метафазные пластинки (рис. 7.2) для исследования хромосом можно получить лишь в том случае, если однослойную культуру зафиксировать в тот момент, когда часть клеток находится в митозе. Делящиеся фибробла-сты характеризуются измененной морфологией; из нормального вытянутого веретена они превращаются в сферические клетки, которые в растущих культурах легко распознаются под микроскопом. Используя этот признак, можно провести приблизительную оценку митотического индекса. Максимум митотической активности для первых субкультур наблюдается приблизительно через 18—24 ч после инокуляции при посеве не менее 5-105 клеток в 5 мл среды Б.
Можно увеличить митотическую активность, воздействуя на субкультуры Холодовым шоком при температуре 4°С в течение 30—60 мин, что частично синхронизирует фазы клеточного цикла [14]. С этой целью в начале следующего дня после посев а клеток для кариоло-гического анализа культуры помещают в холодильник при 4°С обычно на 30 мин. Затем их переносят в термостат при 37 °С и через 30 мин продолжают обработку. Если после трипсинизации клеток для посева прошло не более 24 ч, то нет необходимости применять хо-лодовый шок, однако клетки, пересеянные раньше этого срока, не дают удовлетворительных результатов без воздействия Холодовым шоком. Как правило, максимальную активность получают 'в том случае, если холодовый шок применяют вскоре после пересева клеток.
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 80 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed