Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Препараты, шриготовленные методом высушивания на воздухе, можно долгое время хранить либо до окрашивания, либо после окрашивания и заключения. Это явное преимущество описанного здесь метода, поскольку с помощью ранее применявшейся методики давленых препаратов гораздо труднее было получить постоянные препараты. Требовался большой практический опыт, чтобы достичь результатов, сравнимых с результатами, получаемыми при использовании техники высушивания на воздухе.
Предметные стекла с клетками сохраняют в метиловом спирте. Такая дополнительная фиксация (в отсутствие уксусной кислоты) способствует лучшему окрашиванию.
ОКРАШИВАНИЕ ХРОМОСОМ В МЕТАФАЗНЫХ ПЛАСТИНКАХ ФИБРОБЛАСТОВ
Для окрашивания хромосом фибробластов в основном применяются те же методы, которы-е используются для окрашивания хромосом лейкоцитов человека: реак-
ция Фёльгена, различные варианты окрашивания ацето-орсеином и методика Романовского, Для общего анализа хромосом лучше применять методику окрашивания Романовского, которая дает наиболее интенсивную окраску хромосом — от пурпурной до темно-фиолетовой. Препараты, окрашенные по Романовскому, Фёльгену или ацето-орсеином, просветляют в высококачественном не содержащем серу ксилоле и хранят в темноте, поскольку на свету они выцветают. Ниже приводится вариант окрашивания раствором Май-Грюнвальд—Гимза. Эта методика проста и дает надежные результаты при окрашивании препаратов, изготовленных методом высушивания на воздухе.
Реактивы
0.1.М фосфатный буфер Серенсена, pH 6,8, разбавляют водой в отношении 1 :20.
Раствор Май-Грюнвальд — 0,3 г порошка (С. Т. Gurr Ltd., Carlisle Road, The Hyde, London, N. W.9) постепенно растворяют в 100 мл метилового спирта при 37°С в водяной бане, затем фильтруют. При использовании краситель разбавляют буфером в отношении 2 : 3.
Усовершенствованный Гарром раствор Гимза. При использовании к I ч. красителя добавляют 4 ч. буфера pH 6,8.
Метод
1. Предметные стекла с клетками .промывают в свежем метиловом спирте.
2. Окрашивают разведенным свежим раствором Май-Грюнвальд в течение 3—5 мин.
3. Удаляют красящий раствор Май-Грюнвальд и заменяют его разбавленным раствором Гимза на 20 мин.
4. Быстро промывают водопроводной водой.
5. Дифференцируют в буфере до тех пор, пока цитоплазма не станет бесцветной. В большинстве случаев для этого препарат достаточно ополоснуть в буфере.
6. Осторожно промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.
7. Просветляют в двух сменах ксилола и заключают.
8. Хранят готовые препараты в темноте.
АНАЛИЗ И ФОТОГРАФИРОВАНИЕ ХРОМОСОМ
Анализ метафазных пластииок фибробластов сходен с анализом метафаз трансформированных лимфоцитов из культур лейкоцитов крови. Хромосомы метафазных пластинок фибробластов на препаратах, приготовленных описанным выше способом, как правило, менее конденсированы, чем на препаратах культивированных
Рис. 7.3. Микрофотография метафазной пластинки фибробласта нормального мужчины (rt=46, ХУ).
У-хромосома указана стрелков. Окрашивание раствором Mafi-Грюнвальд —
Гнмза; ХЮОО.
лейкоцитов. Они тоньше и бледнее окрашены, но на них лучше различимы детали строения хромосомы в области вторичных перетяжек, например сателлиты хромо-
21/ tfy с, «И
СУ> ЬОл
Рис. 7.4. Микрофотог.рафня метафазной пластинки фибробласта больного с аномальным числом хромосом: одна из хромосом 17-й нары группы Е — кольцевая (указана стрелкой). Окрапываниу раствором Мап-Грюивальд — Гимта; X1000.
сом групп D и G. Индивидуальные хромосомы классифицируют и идентифицируют по стандартной системе, рекомендованной Денверской исследовательской группой (1960) [19] п на Лондонской конференции (1963) [20]. Стандартная номенклатура, выработанная на конферен-
ции в Чикаго (1966) [21], может быть использована для описания численных и структурных изменений в хромосомном наборе человека.
Необходимыми помощниками при анализе хромосом являются микрофотографии (рис. 7.3 и 7.4). Для достижения максимального разрешения и контраста при фотографировании красновато-пурпурных хромосом, окрашенных по Май-Грюнвальд—Гимза, следует использовать максимально контрастную пленку с высокой разрешающей способностью. Для 35-миллиметровой камеры используют пленку Kodak Recordak Micro-file (тип 5669) в сочетании с зеленым светофильтром Wratten 58. Такую пленку проявляют в особо контрастном проявителе Kodak D8 и в проявителе May and Baker Qualitol. Получающиеся негативы обладают отличным качеством и достаточным контрастом, позволяющим, однако, различать мельчайшие структуры, например сателлиты. Пластинки Ilford chromatic G30 или плоскую пленку Kodak Commercial Ortho рекомендуется проявлять в проявителе Qualitol, разведенном водой в отношении 1:19. Для подсчета хромосом пригодны отпечатки размером 12x16см; для анализа кариотипа—16x21,
ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Ford. С. Е„ Jacobs P. A., Lajtha L. G., Nature, Lond., 181, 1565 (1958).
