Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 7.2. Монослой фибробластов, в котором видны 3 клетки на
разных стадиях митоза.
Окраска забуференным тионином; Х225.
Обработка колхицином
Метафазные пластинки, пригодные для анализа, можно получить и без использования колхицина. Однако выход метафаз намного увеличивается, если за 4—6 ч до конца культивирования в среду добавить колхицин, который останавливает делящиеся клетки в метафазе, так как подавляет образование веретена. Колхицин добавляют из расчета 0,2 мл раствора на 5 мл среды (0,001 мг/мл в растворе Хэнкса) после холодового шока, когда культура согреется. Приблизительно через 5 ч культуры трипсинизируют и получают суспензию отдельных клеток. После центрифугирования раствор трипсина сливают и клетки осторожно ресуспендируют в теплом растворе Хэнкса.
Обработка клеток после добавления колхицина
Харнден [5] рекомендует пересевать клетки, непосредственно предназначенные для карпологического анализа, на покровные стекла, которые помещают в чашки Петри. Фибробласты, выросшие «а покровных стеклах, обрабатывают in situ и получают препараты для изучения хромосом. Недостаток этого метода, кроме необходимости иметь некоторые навыки в обращении с хрупкими- покровными стеклами, состоит еще и в том, что делящиеся сферические фибробласты легко открепляются от стекла и поэтому могут быть утеряны при фиксации. В митотических клетках, прикрепленных к стеклу, наблюдается плохой разброс хромосом, Фроланд [15] объединил метод Харндена [5] с техникой получения метафазных пластинок для исследования хромосом из венозной крови, описанной Мурх-идом и др. [3]. Модифицированный метод Фроланда предполагает на последних стадиях обрабатывать клетки в суспензии. При этом всегда получается хороший разброс метафазных пластинок.
После обработки колхицином среду сливают в мерные конические пробирки и центрифугируют при 1000 об/м пн для того, чтобы осадить открепившиеся клетки. Клетки монослоя дезагрегируют 0,05%-ным раствором трипсина при 37 °С. Полученную суспензию фибробластов соединяют с осадком клеток в центрифужной пробирке, осторожно пипетируют и вновь центрифугируют. Можно избежать небольших потерь клеток на стекле, если центрифужные пробирки и пипетки обработать силикоиирующей жидкостью. Для получения хорошей однородной суспензии клеток нужно брать пипетку с узким концом, диаметр которого не превышает
1 мм.
Обработка гипотоническим раствором
Цитоплазма клеток, хотя и не очень плотная, все же достаточно вязкая, чтобы препятствовать разбрасыванию хромосом при разрыве клеточной мембраны. Для того чтобы получить хороший разброс хромосом на метафазных пластинках, клетки обрабатывают гипотони-
ческим раствором. Для этих целен используют 0,95%-ный цитрат натрия [15], 0,7%-ный цитрат натрия [9],
0,17%-ный раствор NaCl [16], 0,075 М КС1 [17] и различные разведения раствора Хэнкса (например, [5]). Все эти растворы дают удовлетворительный разброс хромосом в метафазе. Мы используем раствор Хэнкса, разведенный в 4 раза. После отмывания клеток раствором Хэнкса обычной концентрации большую часть над-осадочной жидкости сливают; клетки оставляют в 0,5 мл раствора. Затем осторожно, по каплям, добавляют теплую дистиллированную воду до конечного объема 2 мл, так что концентрация раствора Хэнкса уменьшается в 4 раза. В этом разбавленном растворе клетки инкубируют при 37 °С в течение 15—20 мин.
Фиксация и получение разброса хромосом
Осадок клеток в конической пробирке, образовавшийся после центрифугирования гипотонического раствора, фиксируют в течение 30 мин смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), причем фиксирующую смесь лучше готовить непосредственно перед употреблением. После этого сливают надосадочную жидкость и клетки вновь суспендируют в свежем фиксаторе. На этой стадии с помощью силиконированной пипетки Пастера нужно хорошо «разбить» клеточные скопления, чтобы получить равномерную суспензию одиночных клеток. После центрифугирования клетки трижды промывают в свежеприготовленной смеси спирт—уксусная кислота если получается плохой разброс хромосом, то нужна дополнительная смена фиксатора), Наконец, клетки суспендируют в небольшом объеме фиксатора так, чтобы получилась не очень густая опалесцирующая суспензия молочно-белого цвета. Как правило, общий объем должен составлять 0,25 — 0,5 мл.
Разброс хромосом в делящихся клетках осуществляют с помощью модифицированного метода высушивания на воздухе, предложенного Ротфелсом и Симоновичем [18]. Обезжиренные спиртом чистые предметные стекла охлаждают в сосуде Коплина с дистиллированной водой, пока не начнется образование кристаллов льда. Стекло, вынутое из сосуда, покрыто ровной плен-
кой ледяной воды. На верхний конец стекла (стекло держат под углом 45°) наносят каплю клеточной суспензии, которая стекает вниз; слабое обдувание способствует более быстрому распределению клеток по поверхности. Интенсивно помахивая стеклом, препарат несколько подсушивают на воздухе, а затем полностью высушивают над пламенем спиртовки. Процесс высушивания должен быть быстрым и занимать не более 30 с. Высушенный препарат просматривают с помощью микроскопа, чтобы оценить степень разброса делящихся клеток. Приобретя некоторые навыки, можно получать хорошие результаты, Если не удается таким способом получить хороший разброс в метафазных пластинках, то предметное стекло «поджигают», как только капля клеточной суспензии в фиксаторе расползется по поверхности влажного охлажденного стекла; однако в результате такого грубого обращения возникают артефакты, в частности расщепление хроматид и утрата хромосом из-за их сильного разброса и разрыва клеточной мембраны. Поэтому в тех случаях, когда это возможно, желательно не применять технику «поджигания».
