Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Источником фибробластов с успехом может служить материал, полученный при хирургических абортах. Этот материал особенно ценен при подозрении на аномалию плода главным образом потому, что определить характер хромосомного набора порой можно только по фиб-робластам. При самопроизвольных абортах материал, как правило, инфицирован, за исключением тех редких случаев, когда плодные оболочки оказываются целыми. Такой материал использовать не следует. Хорошим источником фибробластов служит кожа, взятая от мертворожденных плодов (нема)церированных), трупов новорожденных, если после смерти прошло менее 24 ч и если трупы были заморожены. Биопсию, взятую от трупа, нужно поместить по крайней мере на один день в среду, содержащую антибиотики (среду необходимо несколько раз сменить), чтобы уменьшить возможность бактериального заражения.
МЕТОД ОДНОСЛОЙНЫХ КУЛЬТУР
ПОЛУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР
Фибробласты и фибробластоподобные клетки кожи и других тканей растут на поверхности сосуда для культивирования и образуют монослой, ирочно прикреплен-
ный к стеклу. Когда вся поверхность для роста зарастает клетками, фибробласты формируют многослойный пласт, который в конце концов отделяется от стекла в виде «шариков» из клеток. Пересевать клетки лучше тогда, когда они еще активно размножаются, т. е. до образования сплошного монослоя. Первичные культуры получают во флаконах Карреля диаметром 45 мм и глубиной 10 мм с узким горлом, плотно закрытым силиконовой резиновой пробкой. Главные преимущества сосудов этого типа для закладки культур фибробластов состоят в том, что: 1) сосуды обладают относительно большой площадью для роста клеток по сравнению с объемом культуральной среды; 2) небольшой объем воздуха над средой способствует поддержанию оптимального значения pH; 3) конструкция флаконов позволяет легко соблюдать асептические условия в течение долгого времени.
Фибробласты начинают делиться in vitro после некоторого «лаг-периода», длительность которого варьирует в зависимости от источника клеток. В течение этого «лаг-периода» клетки должны быть неподвижными и находиться в контакте с поверхностью флакона для того, чтобы приспособиться к искусственным условиям. Ниже мы приводим описание трех методов получения первичных культур.
1. Метод прямого контакта
Первичный рост фибробластов можно получить непосредственно из кусочков быстро размножающихся тканей эмбрионов или новорожденных, которые помещают во флакон Карреля с таким количеством среды А, которое лишь ёдова покрывает дно флакона, и насыщают воздух 5% СО2. Флакон ставят в термостат на 48 ч, в течение которых его не рекомендуется сдвигать или трогать, после чего с помощью инвертированного микроскопа можно наблюдать за образованием 'выростов фибробластов. К этому времени кусочки прочно прикрепляются к стеклу и для образования монослоя общий объем среды увеличивают до 2 мл.
2, Метод трипсинизации
Суспензию одиночных клеток (получают обработкой трипсином измельченного кусочка кожи. Кусочек кожи? полученный при биопсии, помещают в стерильную 6-сантиметровую чашку Петри со стерильным изотоничным 0,04%-ным раствором трипсина и стерильными инструментами разрезают на небольшие фрагменты. После инкубации при 37 °С в течение 30 мин при эпизодическом пилетировании жидкости с помощью пастеровской пипетки образуется густая суспензия клеток. Ее центрифугируют, осадок ресуспендируют в 1—2 мл среды А и помещают во флаконы Карреля, которые инкубируют при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% С02. Отдельные клетки и маленькие кусочки ткани, которые осели на стекло, должны начать делиться через несколько дней. Сходный метод описан Фраккаро и др. [И].
В нашей лаборатории нам редко удавалось получать успешные культуры с помощью этой методики. Фибро-бласты, не адаптированные к условиям in vitro, плохо садятся и прикрепляются к стеклу. На их прикрепление к стеклу влияют даже конвекционные токи в (Культуральной среде. Однако это затруднение можно преодолеть с помощью метода Хсю и Келлога [12] (разработанного на основе метода Эванса и Эрла [13]), предложивших использовать стерильные диски перфорированного целлофана для удержания клеточных агрегатов на месте до тех пор, пока клетки не начнут размножаться.
3. Метод заключения в сгусток плазмы
В сгустке плазмы эксплантаты (кожи прикрепляются к поверхности стекла и через некоторое время из них начинается рост клеток. Кусочек кожи, взятый при биопсии, помещают в стерильную 6-сантиметровую чашку Петри с небольшим количеством среды 199 и, пользуясь стерильными ножницами и пинцетом, разрезают на более мелкие кусочки размером от 0,5 до 1 мм. Черная материя или черная бумага под чашкой Петри способствует лучшему измельчению ткани. Если эти кусочки сразу поместить в сгусток плазмы, то в результате дей-
ствия ферментов через несколько дней они могут открепиться от сгустка; «в таком случае их необходимо перенести в новый флакон Карреля. Протеолитического переваривания сгустка плазмы можно избежать, если биопсийные кусочки поместить во флакон Карреля с 2 -мл среды А с 5% С02 в воздухе и инкубировать их в течение 3—7 дней, прежде чем заключить в сгусток плазмы. Предварительная инкубация перед заключением кусоч'ка в сгусток плазмы почти полностью устраняет опасность преждевременного открепления сгустка и не задерживает начала роста культуры.
