Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Методика Мирвика и др. [28] сводится к следующему:
1. Используют здоровых кроликов весом 1,8—2,2 кг (авторы работали на белых новозеландских кроликах, но можно, конечно, использовать и другие породы). Животных забивают быстрой инъекцией 40 мл воздуха в краевую ушную вену.
2. Вскрывают грудную полость, передний конец трахеи выделяют из окружающих тканей, зажимают, чтобы в нее не поступала кровь, и отрезают впереди зажима. Задний отдел трахеи с зажимом, легкие и сердце извлекают целиком. Осторожно отрезают сердце, следя за тем, чтобы не повредить легкие и бронхи.
3. Препарат отмывают от крови теплым физиологическим раствором, осторожно промокают марлевым там-
поном, на стенку трахеи накладывают второй зажим так, чтобы не порвать ее и не закупорить просвет, и с помощью этого зажима препарат подвешивают.
4. С трахеи снимают зажим и заливают в нее раствор Хэнкса до тех пор, пока легкие не расправятся. Обычно для этого достаточно 30—40 мл раствора; заливать лучше непосредственно в главные бронхи, сначала в один, потом в другой, так как при этом происходит равномерное растяжение всех долей легкого. Затем трахею снова пережимают, легкие осторожно массируют, снимают зажим и жидкость выливают в сосуд. Этот процесс повторяют еще раз.
5. Оба смыва сливают и центрифугируют {20 мин при 1500 об/мин). Если между прозрачной надосадоч-ной жидкостью и осадком клеток окажется мутный слой, состоящий из слизи и фрагментов клеток, его осторожно удаляют пастеровской пипеткой; остальную надосацочную жидкость выливают или отсасывают, а осадок суспендируют в культуральной среде, содержащей 25% аутологичной сыворотки. Суспензию переносят в сосуды для культивирования и инкубируют при 37°С.
Хотя, как уже упоминалось, мы не пользовались этим источником макрофагов и поэтому у нас нет собственного опыта работы с ним, тем не менее некоторые наши замечания могут оказаться полезными.
Для того чтобы избежать бактериального загрязнения, на всех этапах следует строго соблюдать правила асептики, вплоть до использования стерильного воздуха для забивки животных.
Прежде чем вливать в легкие раствор, его лучше подогреть до 37°С, поскольку холодное вливание может вызвать сокращение мускулатуры бронхов. Сосуд, в который выливают смыв, должен быть, наоборот, охлажден, для того чтобы макрофаги не прикреплялись к его стенкам. Центрифугировать смывы нужно на холоду: либо в центрифуге с охлаждением, либо в обычной центрифуге, но с предварительно охлажденными стаканами и пробирками.
Довольно высокая скорость и продолжительное время центрифугирования, указанные в п. 5, используются при стандартной методике, при которой выход клеток
определяется по объему осадка. Если же подсчет клеток в пробе производить так же, как при работе с перитонеальными макрофагами, то скорость центрифугирования можно снизить, что позволит уменьшить механическое повреждение клеток.
Если предположить, что среднее число клеток, получаемое от одного животного, равно 12 000 000, из которых 99% составляют макрофаги, то для получения суспензии с концентрацией 300 000—500 000 клеток в 1 мл требуемый объем среды составляет около 30 мл, т. е. из такой суспензии можно получить большое число культур.
Для получения аутологичной сыворотки можно взять 50 мл крови из краевой ушной вены непосредственно перед введением в нее воздуха при забивке животного. Из этого количества крови получают около 30 мл сыворотки — количество, достаточное для посева клеток и последующей смены среды. После прикрепления макрофагов к стенке сосуда для культивирования исходную среду меняют на свежую теплую среду и таким образом удаляют из культуры не прикрепившиеся посторонние клетки.
Вероятно, не безынтересно упомянуть, что Хейс и др. [37] успешно применили этот метод получения макрофагов из легких морской свинки.
ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Metschrtikoff Е. (18.13, 1884) cited by Cameron R., in Pathology of the Celt, Oliver and Boyd, Edinburgh, 196 (1952).
2. Aschoff L., Kiyono K. (1913) cited by Cameron R., in Pathology of the Cell, Oliver and Boyd, Edinburgh, 205 (1952).
3. Ranvier 1. (1899) cited by Jacoby F., in Cells and Tissues in Culture, Academic Press, London, 2, 27 (1965).
4. Del Rio Hortega P., Penfield's Cytology and Cellular Pathology of (he Nervous System, Hoeber, New York, 2, section 10, 481 (1932).
5. Kupffer C. Von (1898) cited by Cameron P., in Pathology of the Cell, Oliver and Boyd, Edinburgh, 205 (1962).
6. Aschoff L., Lectures on Pathology, Hoeber, New York, chapter 1 (1924).
7. Cappell D. F„ J. Path., Bad., 32, 595 (1929).
8. Cappell D. F., J. Path. Bad., 33, 429 (1930),
9. Downey H. (Ed.) Handbook of Hematology, Hoeber, New York,
I (193b).
10. Jacoby F.. in Colls and Tissues in Culture. Ed. Willmer E. N.. Academic Press, London, 2, chapter 1 (1965).
11 Nelson D. S., Macrophages and Immunity, Vol. 11 of Frontiers of Biology, North Holland Publishing Co., Amsterdam, 1969.
12. Del Rio I!ortega P., De Asua F, J. (1921) cited by Marshall A. H. E., J. Path. Bad., 58, 729 (1946).
