Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
метода реконструкции является быстрота, однако он мало пригоден в случае
большого числа образцов. Кроме того, удаление детергента гель-фильтрацией
приводит к более широкому распределению частиц по размеру, чем в случае
диализа [57]. Более полный перечень методов удаления детергентов можно
найти в обзоре [58].
3.1.2. Реконструкция путем включения белка в уже сформированные
везииулы
Реконструкция путем включения мембранных белков в заранее сформированные
везикулы была успешно осуществлена в нескольких случаях. Этот способ
(рис. 5.4, Б) приводит к более однородной ориентации белка в везикулах
[59]. Белкн с небольшими гидрофобными "хвостами", такие, как колицин 1а
или цитохром Ь5, включаются в липосомы спонтанно, при этом часто
требуются липиды вполне определенного типа. Таким методом была проведена,
например, реконструкция асиалоглико-протеинового рецептора печени [60].
Иногда предварительно полученные липосомы смешивают с белками,
солюбилизированными детергентом, как, например, при реконструкции
гуанилатциклазы [61].
1. К липидам в виде тонкой пленки добавляют буфер так, чтобы их
конечная концентрация была в пределах 1-10 мМ.
Солюб [лпзация и реконструкция мембранных белков
217
2. Мутную суспензию диспергируют с помощью ультразвука, пока раствор не
станет прозрачным. Для этого может потребоваться несколько часов.
Обработку ультразвуком следует проводить в атмосфере азота илн аргона
(более детальное описание см. в работе [62]).
3. Мембраносвязанную форму гуанилатциклазы, очищенную и
солюбилизированную в 0,1%-ном луброле РХ, инкубируют с липосомами в
течение 1-5 ч и затем выделяют реконструированные везикулы
центрифугированием при 300 ООО g в течение 30 мин (другой вариант этого
метода см. ниже при описании методики замораживания - оттаивания).
Измерения ферментативной активности во фракции везикул показали, что в
отличие от некоторых других мембранных белков, описанных в данной главе,
гаунилатциклаза в липосомах имеет Vmax. в 10 раз ниже, чем в растворимой
форме. При этом ферментативная активность сильно зависит как от состава
фосфолипидов, так и от природы входящих в них жирных кислот, хотя прямой
зависимости этих эффектов от длины и степени ненасыщенности
жирнокислотных цепей не было обнаружено.
3.1.3. Реконструкция с помощью обработки ультразвуком и процедуры
замораживания - оттаивания
Метод реконструкции, при котором детергент совсем не используется,
основан на процедурах обработки ультразвуком и замораживания -
оттаивания. Аликвоту белка, не содержащую липидов и детергента, смешивают
с водной дисперсией липидов. Смесь обрабатывают ультразвуком [63] или
быстро замораживают в жидком азоте, затем оттаивают и снова используют
ультразвук [64]. Этот метод хорош тем, что является быстрым и не требует
использования детергентов. Однако он имеет ограниченное применение,
поскольку большинство мембранных белков при удалении липидов и
детергентов подвергаются необратимой денатурации. Денатурация может также
произойти под воздействием ультразвука в течение нескольких секунд. Кроме
того, различия в мощности и конструкции ультразвуковых установок очень
затрудняют стандартизацию условий озвучивания.
Рассмотрим, как с помощью комбинированного подхода был реконструирован
комплекс, содержащий хлорофилл а/Ь [65]. Мембраны хлоропластов
солюбилизировали в 1,5%-ном тритоне Х-100 при конечной концентрации
хлорофилла 3 мМ. Полученную суспензию добавляли к равному объему липидов
(10 мг/мл), обработанных ультразвуком, перемешивали н затем три раза
проводили операцию замораживания - оттаивания. Остатки тритона Х-100
удаляли смолой биобидс SM-2, образец центрн-
218
Глава Б
фугировали для отделения смолы ч затем трижды замораживали- оттаивали. В
результате были получены преимущественно у.оноламеллярные везикулы с
небольшой примесью более крупных мультнламеллярных фрагментов.
3.2. Морфологическая характеристика везикул
Для полной характеристики реконструированной системы необходимо знать
морфологию полученных частиц. В идеале реконструированные везикулы должны
быть гомогенными по форме, размеру и характеру распределения в них белка.
Однако на деле при реконструкции нередко образуется гетерогенная смесь
как липидных, так и липидно-белковых везикул, что может серьезно
осложнить изучение белков, выполняющих транспортные функции [40J. В этом
разделе описаны некоторые методы, широко используемые для морфологической
характеристики везикул.
3.2.1. Электронная микроскопия
Визуальный анализ реконструированных мембран с помощью электронной
микроскопии - это самый лучший способ характеристики частиц,
присутствующих в образце, по размеру и форме. Чаще всего используют два
метода - негативное контрастирование и замораживание - скалывание.
Детальное описание этих методов не входит в задачи данной главы (оно дано
в работе [66]), но в ней рассмотрены их преимущества и недостатки.
Приемы, используемые для характеристики липидных везикул, как правило,
