Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
и белков [23], однако на практике чаще всего берут литературные значения
ККМ (см. табл. 5.1). С помощью параметра р пытаются выразить мольное
отношение детергента, находящегося в миделлярном состоянии, к взятому
фосфолипиду. К сожалению, из-за действия ряда факторов на процесс
реконструкции трудно рассчитать и сравнить значения р для различных
белков, описанных в литературе, но некоторые обобщения все же можно
сделать. Например, есть основания полагать, что с ростом р степень
солюбилизации будет возрастать. В случае рецептора IgE она достигает 90%
при р>2. Однако с увеличением р возрастает вероятность денатурации белка.
Для ацетилхолинового рецептора и рецептора IgE оптимальными являются
значения р от 2 до 10 (большая часть экспериментов по реконструкции
проведена при значениях р (c)коло 2). Когда мембраны, содержащие
ацетилхолиновый рецептор (2,5 мг/мл белка, 1,2 мМ нативного фосфолипида),
солюбилизируют в 1%-ном (в/о) холате, т. е. при р=9, функция ионного
канала после реконструкции восстанавливается. Если же концентрацию холата
поднять до 2% (в/о), когда р составляет около 29, то происходит заметная
инактивация ионных каналов, хотя остальные экспериментальные условия
остаются такими же [30]. Для карнитин/ацилкарнитин-трансферазы как при
солюбилизации, так и при реконструкции оптимальными являются значения р
от 1,5 до 2,0 [31]. К сожалению, все обстоит намного сложнее, чем можно
было бы ожидать на основании только рассмотрения значений р, поскольку
этот параметр не учитывает специфики липид-детергентных взаимодействий.
2.3.2. Влияние липидов на стабильность белков
Роль фосфолипидов в стабилизации мембранных белков начинает проясняться
только сейчас [32], хотя уже давно известно, что полное удаление липидов
из биологических мембран сопровождается инактивацией большинства
мембранных белков [33-35] даже в присутствии детергентов. Иногда полное
удаление липидов в условиях солюбилизации (или реконструкции) приводит к
агрегации и осаждению белков.
Важность липидов для стабилизации белков предопределяет некоторые
практические меры, которые можно предпринять, чтобы свести к минимуму
денатурацию. Самые простые способы связаны с учетом свойств используемых
детергентов. Например, делипидизирующую активность некоторых детергентов
можно снизить, меняя такие параметры, как температура, ионная сила и pH.
Еще один путь - простое уменьшение концентрации детергента, однако это
может повлиять на эффективность
14-1488
210
Глава 5
солюбилизации. Если детергент должен быть использован в высокой
концентрации, то может оказаться полезным сократить время нахождения
белка в детергентном растворе, применяя, например, методы быстрой
реконструкции.
Делипидизацня белков, происходящая при их очистке на аффинных сорбентах,
иногда представляет серьезную проблему, и чтобы решить ее, возможно,
потребуется добавлять липиды во все элюирующие растворы [36, 37J. Во
многих случаях присутствия собственных липидов в солюбилизируемом
препарате бывает достаточно, чтобы защитить белки от денатурирующего
действия детергентов. Однако при добавлении "защитных" липидов
солюбилизацию можно проводить и при таких концентрациях детергента,
которые в других условиях вызвали бы денатурацию [38, 39J. По-видимому,
защитные липиды снижают фактор р. Пока неясно, одинаковы или нет защитные
функции разных липидов. Однако не вызывает сомнений, что чувствительность
некоторых белков к денатурации может зависеть от комбинации детергента и
липида. Например, рецептор IgE более подвержен денатурации при
использовании в качестве детергента CHAPS в сочетании с азолектином, чем
в комбинации с нативными липидами опухолевого происхождения [26J. Другой
пример: ацетилхолиновый рецептор был успешно реконструирован прн
использовании октилглюкозида в сочетании с нативными липидами Torpedo,
но, когда октилглю-козпд был взят вместе с азолектином, наблюдалась
инактивация белка [40J. В связи с этим интересной представляется идея о
том, что успех применения CHAPS, холата и дигитонина обусловлен
способностью этих стероидных производных заменять холестерол - липид,
который, вероятно, стабилизирует некоторые мембранные белки [41].
2.3.3. Влияние лигандов на стабилизацию функциональной активности
белков
Особенность многих мембранных белков состоит в том, что они могут
находиться в нескольких конформационных состояниях, которые
характеризуются разным сродством к определенным лигандам. Примерами таких
белков являются рецепторы [42, 43], ферменты [44, 45] и ионные каналы
[46]. Переход между конформационными состояниями часто связан с
изменениями липидного окружения [47-49], н солюбилизация может оказаться
благоприятной для одного состояния в ущерб другим. Часто детергенты
необратимо изменяют характер сродства в пользу некоторого вырожденного
состояния, которое возникает вследствие денатурации, обусловленной
удалением липидов по механизмам, обсуждавшимся выше. Нередко денатурацию
