Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
формируются весьма разнообразные структуры. Азолектин при этом образует
моноламеллярные везикулы, в которые равномерно включен АцХР. ДОФХ
образует везикулы, не содержащие АцХР, сам же АцХР находится в растворе в
виде агрегатов; из ДЭФХ формируются крупные "зонтики" с молекулами АцХР
по краям. Если же холат быстро удаляют методом разбавления [76] или гель-
фильтрацией [73], все три липида образуют моноламеллярные везикулы с
АцХР, включенным в бислой. Конечно, проводя систематическое изучение
факторов, влияющих на реконструкцию, исследователь прежде всего ставит
задачу успешно реконструировать функцию изучаемого мембранного белка.
Однако при этом необходимо помнить, что функциональную активность белка
не удается обнаружить, если реконструированная мембрана имеет
неподходящую для проявления этой функции морфологию.
3.3.5. Влияние замораживания - оттаивания
Как известно, липидные везикулы самопроизвольно сливаются прн
температурах ниже температуры их фазового перехода [66]. Способность
везикул к слиянию была использована при реконструкции АцХР, чтобы
получить более крупные везикулы, которые должны давать более сильный
функциональный отклик при измерении транспортной активности, чем исходные
везикулы. Анхольт и др. [39] показали, что размер везикул при
замораживании - оттаивании увеличивается только тогда, когда в
азолектиновые везикулы, содержащие АцХР, включали еще и холестерол. До
замораживания - оттаивания лишь 3% везикул имели диаметр более 100 нм, но
после этой обработки их доля возросла до 24% Однако в другом
исследовании, где также меняли липидный состав, было показано, что
возрастание внутреннего объема, наблюдаемое в случае везикул,
подвергшихся замораживанию, не коррелирует с содержанием холес-
15-1488
226
Глава 5
терола [77J. Общей проблемой, с которой сталкиваются при реконструкции,
является гетерогенность везикул. При включении АцХР методом холатного
диализа в липидные смеси разного состава были получены две фракции
везикул, разделяемые в градиенте сахарозы, одна из которых состояла
только из липидов [71]. После нескольких циклов замораживания -
оттаивания два пика, отвечающие этим двум фракциям, слились в один,
расположенный в области промежуточной плотности раствора сахарозы. Этот
препарат хорошо захватывал радиоактивные катионы и использовался для
измерений ионного транспорта, однако неясно, с чем было связано кажущееся
увеличение функциональной активности: с ростом внутреннего объема
везикул, с "герметизацией" мембраны или с действием каких-либо других
факторов. Электронные микрофотографии с негативным контрастированием
препаратов мембран, содержащих АцХР, после процедуры замораживания -
оттаивания свидетельствуют о поразительной гетерогенности препаратов и
заметном возрастании содержания в них многослойных везикул [10]. Имеются
также данные, основанные на результатах электронной микроскопии
замороженных сколов, о том, что замораживание - оттаивание мембран может
привести к захвату некоторых белков везикулами, а не к включению их в
липидный бислой [10]. Если замораживание необходимо для длительного
хранения везикул, то можно добавить сахарозу, чтобы предотвратить
образование многослойных везикул при оттаивании [78].
3.4. Характеристика реконструированных везикул
3.4.1. Измерение внутреннего объема
Простой метод определения объема водной фазы, включенной внутрь
реконструированных везикул или липосом, состоит в проведении
реконструкции в присутствии 0,1 М хромата натрия или калия. Не вошедший в
везикулы хромат удаляют гель-фильтрацией, а хромат, захваченный
везикулами, высвобождают солюбилизацией аликвоты в 10 мМ тритоне Х-100 и
затем определяют его концентрацию по поглощению света при 380 нм. Чтобы
найти удельный внутренний объем, выраженный в литрах на моль липида,
концентрацию хромата в аликвоте относят к общей концентрации хромата и
липида в образце [62].
В качестве других индикаторов при определении внутреннего водного объема
используют 0,1 мМ 6-карбоксифлуоресце-ин, концентрацию которого
определяют по его флуоресценции [62], или радиоактивные сахара, такие,
как [14С]-лактоза [79] или [3Н]-декстран [80], содержание которых
измеряют с помощью сцинтилляционного счетчика. Следует удостовериться.
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
227
что индикатор не действует на функциональную активность реконструируемого
белка и не влияет на ход самой реконструкции.
Определение внутреннего объема облегчается, если мембрана содержит белки,
проявляющие свойства ионного канала, типа АцХР и натриевого канала.
Везикулы инкубируют в течение ночи с радиоактивными ионами, проникающими
через ка* нал; не вошедшие ионы удаляют с помощью ионообменной колонки
[37, 81] и измеряют радиоактивность ионов, захваченных везикулами. __
3.4.2. Измерение проницаемости везикул
Данные по проницаемости везикул особенно важны, когда необходимо
установить трансмембранную ориентацию белка в бислое или измерить его
