Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
меньше, но не ниже 1 мг/мл.)
3. К двум объемам препарата очищенного ацетилхолинового рецептора
добавляют один объем смеси азолектин-холат, приготовленной на стадии 1.
Конечные концентрации компонентов должны приблизительно составлять: 2%
для холата, 20 мг/мл для липида и 1 мг/мл для ацетилхолинового рецептора,
что отвечает мольному отношению липид/белок, равному 6700/1.
4. Диализуют суспензию против 4 л буфера БД-1 в течение по крайней мере
48 ч с тремя сменами буфера. Используют диализные трубки Spectra-Pore,
предварительно вымоченные в буфере БД-1, содержащем 1%-ный холат.
5. Полученные прн диализе мембранные препараты можно хранить не менее 2
иед при 4СС без заметной потерн функциональной активности. Их можно также
хранить замороженными в жидком азоте. Однако замораживание - оттаивание
приведет к изменению размера и степени гомогенности везикул.
') Фирма Associated Concentrates, Woodside, N Y.
нового рецептора ориентируются так, что их наружный домен находится на
поверхности везикул независимо от условий реконструкции. Напротив,
натриевый канал, имеющий такие же размеры, как и ацетилхолиновый
рецептор, по-видимому, ориентирован хаотически в реконструированных
системах; об этом свидетельствуют все проведенные до сих пор исследования
[91J - Еще один интегральный мембранный белок, который, по-видимому,
ориентируется в реконструированных мембранах хаотично,- это
бактериородопсин [63, 89J. На трансмембранную ориентацию белка может
влиять и его пространственная конфигурация. Например, ацетилхолиновый
рецептор имеет крайне асимметричную воронкообразную форму [92]; возможно,
этим и объясняется его четко выраженная склонность к векторной
трансмембранной ориентации в отличие от бактериородопсина, имеющего
бочкообразную форму [68].
3.5. Реконструкция ацетилхолинового рецептора
В табл. 5.8 последовательно описана методика, которая успешно применялась
для приготовления реконструированных мембран, содержащих функционально
активный ацетилхолиновый рецептор электрического органа Torpedo.
Детергент удаляли диализом, что позволило получить везикулы, пригодные
для измерения ионных потоков. Аналогичную методику можно использовать и
для других мембранных белков.
232
Глава 5
4. Определение функциональной активности реконструированных мембран
Основная задача реконструкции состоит в том, чтобы создать для мембранных
белков такое окружение, которое позволило бы измерить и охарактеризовать
их функциональную активность. Многие методы эффективной солюбилизации и
реконструкции, описанные в предыдущих разделах, преследуют цель сохранить
функциональную целостность мембранных белков и максимально облегчить
определение их активности с помощью традиционных аналитических методик. В
этом разделе мы рассмотрим ряд общих методов биохимического анализа
мембранных белков как в солюбилизированном, так и в реконструированном
состоянии.
Чаще всего этот анализ основан на определении связывания лигандов,
измерении ферментативной активности и определении транспортных
характеристик или проницаемости. В некоторых реконструированных системах
удается также показать наличие функционального сопряжения между
различными белками.
4.1. Определение связывания и ферментативной активности
Как правило, эти измерения можно проводить на всех стадиях очистки,
поскольку методы анализа обычно применимы к белку в нативном окружении,
белку в солюбилизированном состоянии и к реконструированному белку.
Многие теоретические и практические вопросы определения ферментативной
активности и связывания лигандов одинаковы как для белков, находящихся в
растворе, так и для белков, связанных с мембранами, и поэтому мы не будем
останавливаться на них подробно. Например, в обоих случаях необходимо
убедиться в том, что связывание происходит в условиях насыщения, является
избирательным, стереоспецифичным, обратимым и ингибируемым. Однако в
случае мембранных белков есть целый ряд уникальных проблем, которые
заслуживают специального рассмотрения.
В условиях солюбилизации детергент может повлиять на эффективную
концентрацию субстрата или лиганда, доступного для белка. Например, если
субстрат является амфифильным веществом, то он может накапливаться в
мицеллах детергента, что затруднит его взаимодействие с активным центром
фермента. Под влиянием детергента может измениться конформация белковой
молекулы и тем самым свойства белка как фермента. Возможно также, что
детергент "обнажит" активные центры фермента или участки аллостерического
взаимодействия, кото-
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков_____________233
Таблица 5.9. Методы, применяемые для анализа связывания лигандов
солюбилизированными белками
Метод
Пояснения
Г ель-фильтрация
Фильтрация
Ультрацентрифугпро-
вание
Равновесный диализ Проточный диализ
Осаждение полиэти-ленгликолем Иммунологические методы
Процедура занимает много времени. Неприменима для большого числа
образцов. Детергент может повлиять на разделение.
