Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
захвата ионов везикулами к смеси через определенные промежутки времени
добавляют ингибитор (кураре). Стадия ингибирования особенно важна при
регистрации очень быстрых процессов с использованием системы быстрого
смешивания [109], показанной на рис. 5.6. Добавлять ингибитор не
требуется в тех случаях, когда реакцию проводят почти до состояния
равновесия (10-30 с), как это описано в табл. 5.11. Обработав
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
24"
рецептар
Рис. 5.5. Схема экспериментов по измерению быстрой кинетики ионного
транспорта в реконструированных везикулах, содержащих ацетилхолиновый
рецептор. В левой части рисунка представлена схема активации ионного
канала ацетичхолинового рецептора агонистами; детальное описание этого
эксперимента приведено в табл. 5.11. Справа показана схема
предварительной инкубации, позволяющая изучать кинетику десенситизации
ионного канала агонистами, например карбамилхолином. Измерения ионного
потока, направленного внутрь везикул при обычном смешивании реагентов,
можно провести за время от нескольких секунд до минуты. Чтобы определить
начальные скорости, необходимо использовать специальные устройства для
быстрого смешивания на стадиях предварительной инкубации, измерения
ионного потока и ингибирования канала. Схема проточной системы для
быстрого ингибирования приведена
на рис. 5.6.
16-1488
242
Глава 5
Piic. 5.6. Проточная система для регистрации активации ионного канала
ацетилхолинового рецептора. Используются два основных режима. В
непрерывном режиме мембраны, агонист и раствор ингибитора подаются из
отдельных шприцев с помощью одного упора с пневматическим приводом. Чтобы
уменьшить турбулентность потока, подачу осуществляют импульсами
длительностью 100 мс. Время реакции между ацетилхолиновым рецептором и
агонистом определяется длиной трубки между двумя смесителями.
Ингибирование происходит во втором смесителе и затем производится
отделение везикул от незахва-ченных ими ионов. Изменяя длину трубки,
можно менять длительность реакции в интервале 10-100 мс. Для более
длительных реакций используют периодический режим. Мембраны, меченые ионы
и агонист смешивают и оставляют в трубке-накопителе. В определенный
момент времени включают второй привод, буфером вытесняют реакционную
смесь из трубки-накопнтеля и вводят ее в реакцию с ингибитором. Более
подробное описание применяемой аппара-I туры и анализа экспериментальных
данных см. в работе [40]. (Из работы [40].)
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
243
oso;
ADSA
ANTS
Интенсивная
флуоресценция
Флуоресцентный проситель (i^L)
.JL. Цикл заморомиваниа-~ оттаивания
Колоночная хроматография или центрифугирование
Й - (ti*Cs) * буфер 0 $
Быстрое
спешивание
Интенсивная
флуоресценция
рГ= (TljCs) t Carb (в )
Тушение флуоресценции
Рис. 5.7. Схема измерений методом тушения флуоресценции кинетики быстрого
ионного транспорта в реконструированных везикулах, содержащих
ацетилхолиновый рецептор, с помощью системы остановленной струи.
Аппаратурная часть системы такая же, как и в методе проточного
ингибирования. Основное отличие состоит в том, что флуоресценцию
реакционной смеси измеряют непрерывно в кювете, расположенной после
смесителя. Таким образом, на одном образце можно получить всю временную
зависимость. (Из работы [40].)
16*
244
Глава 5
Таблица 5.11. Методы определения транспортной активности ацетилхолинового
рецептора с использованием ионообменных колонок (см. рис. 5.5)
1. Готовят колонку со смолой дауэкс.
а. Промывают 500 г катионообменной смолы дауэкс 50W-X8 (50-100 меш; Sigma
Stock JV° 50X8-100) дистиллированной водой до тех пор, пока надосадочная
жидкость не станет прозрачной. К одному объему смолы в смеси с одним
объемом воды добавляют 220 г трис-основания и инкубируют, осторожно
перемешивая, в течение 1 ч прн комнатной температуре. Проверяют pH (он
должен быть равен 10,6). Тщательно промывают смолу дистиллированной водой
до pH 7 (требуется по меньшей мере 25 промывок). Промывают несколько раз
дважды дистиллированной водой и хранят прн 4°С.
б. Готовят колонку одноразового использования объемом 2 мл (например,
Isolab QS-Y), заполняя ее смолой почти доверху, и промывают 170 мМ
раствором сахарозы, содержащим 3,3 мг/мл БСА (чтобы блокировать центры
неспецифнческого связывания). Сливают буфер с колонки так, чтобы его
уровень был чуть выше уровня смолы, и хранят ее до использования в
закрытом состоянии при 4°С.
:2. Готовят растворы для регистрации захвата ионов. Их должно хватить на
50-60 анализов, что соответствует примерно 10 образцам. Объемы можно
пропорционально увеличить пли уменьшить.
а. IFA-1: смешивают 50 мкл исходного раствора Rb+ и 250 мкл буфера БД-1
(табл. 5.5).
б. Carb*>: растворяют 18,2 мг карбамидхолина в 1 мл воды (0,1 М Carb).
Добавляют 100 мкл 0,1 М Carb к 700 мкл буфера БД-1 (12,5 мМ Carb).
в. IFA-1/Carb: смешивают 125 мкл IFA-1 и 125 мкл 12,5 мМ Carb.
г. IFA-1/Buff: смешивают 125 мкл IFA-1 с 125 мкл буфера БД-1.