Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Быстрый метод. Позволяет анализировать много образцов. Непригоден прн
быстрой диссоциации лиганда (/<15 с). Имеется широкий спектр различных
фильтров.
Процедура занимает много времени. Можно анализировать только ограниченное
число образцов. Возможен захват несвязанного лиганда (однако
центрифугированием через слой масла можно снизить его до минимального
уровня; см. Приложение IV).
Занимает очень много времени. Позволяет проводить измерения в условиях
равновесия.
Быстрый метод. Позволяет изменять концентрацию лиганда в одном образце в
широких пределах. Затруднения обычно вызывает неспецнфическое связывание
лиганда.
Быстрый метод. Позволяет использовать фильтрование или центрифугирование.
Необходимы специфичные антитела.
рые были экранированы, когда белок находился в мембранном окружении. Все
это означает, что на практике необходимо выбирать такой метод анализа,
который гарантировал бы достоверные измерения полной активности
изучаемого белка. Для фермента в составе мембраны и в солюбилизированном
состоянии необходимо измерить как /См, так и Ушах- В случае белков, для
которых можно измерить только связывание, следует определить Кл и общее
число центров связывания; обычно это делают с помощью графика Скэтчарда.
Обнаруживаемые при этом различия могут быть либо артефактом, связанным с
изменением доступности субстрата для белка в составе мембраны или в
солюбилизированном состоянии, либо свидетельством интересных изменений
свойств самого белка.
Анализ мембраносвязанных белков облегчается благодаря по крайней мере
одному обстоятельству. При определении активности белка по связыванию в
отличие от методов определения ферментативной активности в большинстве
случаев требуется отделить свободный лиганд от связанного с помощью
какого-либо физического метода. В случае мембран такое разделение обычно
удается легко осуществить с помощью центрифу-
234
Глава 5
гирования или фильтрования через стекловолокнистые фильтры с определенным
размером пор. Конечно, при разделении может произойти нарушение
'равновесия, установившегося между лигандом и центром связывания, однако
разделение происходит достаточно быстро, чтобы получить вполне приемлемые
результаты. Использование микроцентрифуг, ультрацентрифуг с воздушным
приводом и специальных многогнездовых фильтровальных устройств позволяет
анализировать большое число образцов. В некоторых случаях метод
фильтрования может оказаться пригодным и для солюбилизированных белков.
Основная проблема при анализе связывания методом фильтрования состоит в
том, что промывание фильтра, необходимое для снижения фонового уровня
несвязавшегося лиганда, часто приводит к вымыванию связанного лиганда,
если он не обладает высоким сродством к белку (т. е. при /Сд=Ю-7 М или
меньше). Ниже мы рассмотрим несколько примеров анализа белков по
связыванию и по их ферментативной активности, с тем чтобы ознакомить
читателя с практически используемыми методиками (см. также работу [93J).
В табл. 5.9 суммированы методы отделения свободного лиганда от
связанного, обычно применяющиеся для мембраносвязанных и
солюбилизированных белков, а в Приложении III детально описан метод,
основанный на использовании масляных слоев, о котором ранее не
сообщалось.
4.1.1. Ацетилхолиновый рецептор
Ацетилхолиновый рецептор специфично связывает а-бун-гаротоксин -
положительно заряженный белок змеиного яда - с высоким сродством (Кд =
10-11 М). Имеются также производные токсина, меченные радиоактивным
иодом. Если избыток радиоактивного токсина проинкубировать с
ацетилхолиновым рецептором в детергентном растворе в течение 30-60 мин
при комнатной температуре [обычно берут 50 мкл раствора, содержащего
тритон Х-100 (0,2%), токсин (30 нМ) и ацетилхолиновый рецептор (5 нМ)],
то комплекс рецептора с токсином удается легко отделить от несвязавшегося
токсина пропусканием смеси через ДЭАЭ-целлюлозный фильтр. Положительно
заряженный фильтр задерживает комплекс, несущий отрицательный заряд, и
пропускает несвязавшийся с рецептором токсин. Благодаря очень прочному
связыванию токсина с ацетилхолиновым рецептором можно тщательно отмыть
фильтр от несвя-завшейся метки [47, 81, 94J. Поскольку этот метод анализа
основан на принципах ионного обмена, необходимо использовать ненонные
детергенты (такие, как тритон Х-100). Можно проводить анализ, сначала
инкубируя мембраны с соответствующими лигандами, а затем растворяя их в
детергенте перед
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
235
фильтрованием. Постадийное описание этой методики приведено в табл. 5.10.
Кажущееся значение Кл низкомолекулярных активирующих лигандов можно
определить описанным выше методом по их способности конкурировать с
токсином за места связывания. Этот подход был использован также для того,
чтобы показать изменения во времени сродства ацетилхолинового рецептора к
активирующим лигандам, таким, как карбамилхолин. Предварительная
инкубация ацетилхолинового рецептора с карбамил-холином переводит
