Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
транспортные характеристики. Ван-дер-Штеен и др. [80] тщательно изучили
влияние гликофорина на проницаемость диолеоилфосфатидилхолиновых везикул,
одновременно измеряя в них содержание захваченного [3Н] -дек-страна и
калия. Методика состоит в следующем.
1. Готовят везикулы в присутствии 0,2%-ного (в/о) [3Н]-дек-страна.
2. Удаляют не проникший в везикулы декстран хроматографией на сефарозе
CL-4B.
3. Везикулы, вышедшие в свободном объеме колонки, осаждают
центрифугированием в течение 1 ч при 100 ООО g, затем наносят их на
колонку с сефадексом G-50, уравновешенную раствором холинхлорида, чтобы
удалить не вошедшие в везикулы ионы К+.
4. Выход ионов К+ из везикул регистрируют с помощью калиевого электрода,
а внутренний объем определяют по радиоактивности декстрана.
Полагая, что выход К+ из везикул следует кинетике первого порядка, по
изменению содержания ионов К+ во внешнем растворе можно определить
характерное время транспорта калия.
3.4.3. Определение трансмембранной ориентации белка
Наиболее распространенный метод определения ориентации белка в мембране
заключается в измерении его функциональной активности в присутствии и в
отсутствие солюбилизирующего детергента. Некоторые мембранные белки имеют
специфические участки, расположенные на наружной поверхности везикул,
связывающие с высоким сродством радиоактивные лиганды или токсины.
Везикулы, связавшие лиганд или токсин,
15*
228
Глава 5
можно затем отделить от свободного токсина с помощью хроматографии на
колонке или фильтрации через ионообменные фильтры (см., например, [81,
82]). Если связывание специфично и не зависит от присутствия детергента,
то измеряя связывание до и после солюбилизации везикул, удается
определить долю белков, экспонированных на поверхности везикул.
Ферментативную активность можно измерять как в присутствии детергента,
так и в его отсутствие, но следует тщательно отнестись к выбору
детергента. Например, в случае оксидазы цитохрома с только твин 80 (3%,
о/о) не влияет на ее ферментативную активность [83].
У многих мембранных белков внеклеточный домен глико-зилирован. В этом
случае ориентацию белка можно определить по доступности сиаловой кислоты
для нейраминидазы [78, 80, 84]. Везикулы, содержащие белок, обрабатывают
нейраминида-зой в присутствии и в отсутствие тритона Х-100 и сравнивают
количество высвободившейся сиаловой кислоты. Недостатком этого метода
является его неспецифичность: если реконструи-
рованный белок недостаточно хорошо очищен, то присутствие других
гликозилированных белков может исказить результаты.
Для выяснения трансмембранной ориентации белка можно использовать
моноклональные антитела, специфичные к его наружному или внутреннему
домену. Анхольт и др. [85] использовали моноклональные антитела для
нммунопреципита-ции ацетилхолиновых рецепторов, которые были
предварительно помечены радиоактивным токсином. Ориентацию определяли по
степени связывания моноклональных антител с рецептором в присутствии и в
отсутствие 0,3%-ного (в/о) сапонина, под действием которого мембрана
становится проницаемой [85].
Недостаток всех перечисленных выше методов связан с тем, что они могут
давать завышенную оценку доли молекул, имеющих неупорядоченную
ориентацию, если реконструированная мембрана проницаема для векторной
метки в отсутствие детергента (или если мембрана не образует замкнутой
везикулы). Аналогично интерпретация экспериментов по установлению
ориентации белка в мембране может оказаться ошибочной, если белок не
включается в мембрану, а проникает внутрь замкнутых везикул [80]. Эти
проблемы можно решить, если тщательно измерять внутренний объем везикул и
их проницаемость, а также проводить электронно-микроскопический контроль.
Имеются по меньшей мере два метода определения трансмембранной ориентации
белков по данным электронной микроскопии, хотя эти методы, возможно,
менее надежны, чем описанные выше биохимические подходы. Так, Саито и др.
[87, 88] предложили фиксировать реконструированные везикулы с по-
Солюбилизация " реконструкция мембранных белков
229
мощью танниновой кислоты и осмия с последующей заливкой в смолу и
получением тонких срезов. В проведенных ими экспериментах интенсивно
прокрашивались только те белковые домены, которые в нативных мембранах
находились на наружной поверхности. Появление интенсивно окрашенного слоя
на внутренней поверхности везикул, по мнению авторов, свидетельствовало о
том, что белок не имеет векторной ориентации. При использовании этого
метода необходимо тщательно контролировать проницаемость мембраны в ходе
прокрашивания и убедиться в асимметричном характере прокрашивания
исследуемого белка.
Другой метод установления ориентации белка в реконструированных мембранах
по данным электронной микроскопии основан на исследовании препаратов,
приготовленных по методике замораживания - скалывания. Чен и Хаббелл [89]
показали, что в нативной мембране родопсин всегда находится на
