Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 99

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 191 >> Следующая

применимы и для реконструированных мембран, хотя реагенты, используемые
для негативного контрастирования, могут быть иными.
При подготовке препарата для проведения электронной микроскопии методом
негативного контрастирования разбавленную суспензию реконструированных
мембран (обычно в концентрации 0,1 мг липида в 1 мл) наносят на медную
сеточку, покрытую полимерной пленкой типа парлодня или формвара. На
пленку напылен углерод в качестве подложки. Образец, находящийся на
сеточке, обрабатывают контрастирующим раствором соли тяжелого металла
(уранилацетат или фосфовольфра-мат натрия), и затем излишки раствора
удаляют фильтровальной бумагой. При контрастировании реконструированных
везикул концентрацию и pH промывающего и контрастирующего растворов
подбирают так, чтобы морфология везикул по возможности не претерпевала
изменений [67]. Метод негативного контрастирования является очень быстрым
(требуется всего около 30 мин на один препарат от момента его
приготовления
Солюбил! зация и реконструкция мембранных белков
219
до просмотра в электронном микроскопе); он позволяет просмотреть за
несколько часов большое число образцов. Еще одно его преимущество в том,
что можно проводить анализ изображений с довольно высоким разрешением
(см., например, рис. 5.3) - при условии, что дозы облучения электронами
не настолько велики, чтобы вызвать радиационное разрушение образца. В
частности, по электронным микрофотографиям, получаемым с помощью метода
негативного контрастирования, обычно проводят анализ изображений с целью
реконструкции трехмерной структуры мембранных белков [68].
При электронной микроскопии методом замораживания - скалывания осажденный
центрифугированием препарат реконструированных мембран быстро
замораживают и затем скалывают, так что при этом обнажается внутренняя
часть бислоя. На поверхность скола под углом 45° напыляют платину, а под
прямым углом - углерод в качестве подложки. Полученная таким образом
платиново-углеродная реплика отражает рельеф мембранной поверхности,
являясь ее точной копией. Интегральные мембранные белки проявляются как
выпуклости либо углубления на реплике, при этом далеко не всегда каждая
выпуклость (или виутримембранная частица, ВМЧ) соответствует одному
белку: нередко несколько белков ассоциируют, образуя ВМЧ. Преимущества
этого метода состоят в том, что с его помощью можно более точно
охарактеризовать распределение белка в бислое и установить, является ли
везикула моноламеллярной или многослойной, а также включены ли внутрь ее
белки. Недостаток же в том, что его разрешающая способность ограничена
размерами платиновых гранул, покрывающих поверхность белка, поэтому
количественная оценка размера внутримембран-ных частиц затруднительна,
хотя и не является абсолютно невозможной. Кроме того, возникают проблемы
и при нахождении распределения везикул по размеру, поскольку их кажущийся
диаметр зависит от того, как проходит скол через везикулы. Истинному'
диаметру везикул отвечают только наибольшие из наблюдаемых размеров.
Большие успехи были достигнуты за последнее время в развитии
криоэлектронной микроскопии. Можно надеяться, что этот метод внесет
значительный вклад в визуальный анализ реконструированных мембран [69].
Суть метода заключается в следующем. Водную суспензию изучаемого
препарата наносят на не покрытую полимером сеточку, избыток жидкости
удаляют с помощью фильтровальной бумаги и сеточку затем окунают в жидкий
этан. При быстром замораживании образуется стекловидный лед. С помощью
специального охлаждаемого приспособления сеточку с образцом постоянно
держат при температуре жидкого азота, благодаря чему становится возможным
пря-
Рнс. 5.3. Электронные микрофотографии ацетилхолинового рецептора. А.
Нативная мембранная везикула из грубого гомогената электрического органа
Torpedo californica. Ясно видны розетки ацетилхолинового рецептора. Б.
Препарат, полученный из А солюбилизацией холатом натрия в присутствии
липида (диолеоилфосфатидилхолина) и очищенный с помощью аффинной
хроматографии на колонке с бромацетилхолином. Розетки ацетилхолинового
рецептора имеют вид димеров, мономеров и олигомеров. Увеличение такое же,
как и в случае А. В. Препарат, полученный из Б диализом против буфера, не
содержащего холата. Образуются незамкнутые бнслойные мембранные фрагменты
(ф=218). Увеличение такое же, как и для А. Г. Препарат, полученный из Б
инкубацией с 2/з объема липидно-холатной суспензии (60 мг/мл азолектина,
4% холата) с последующим диализом против буфера, не содержащего холата.
Везикулы обладают хорошими транспортными характеристиками по отношению к
ионам (<р= 10 ООО). Различимы димеры и мономеры (/) при виде сбоку.
Везикула 2 - безбелковая липосома. Структс ра 3 идентифицирована как
мицелла, поскольку ее диаметр меньше предельного размера (24 нм) для
бислойных везикул. Увеличение такое же, как и в случае А. Все препараты
для электронной микроскопии приготовлены нанесением 25-250 нг бе чка на
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed