Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Солюбилизация " реконструкция мембранных белков
225
/липид: прн мольном отношении октилглюкозид/фосфатидилхо-лин 15: 1
получаются более крупные и более гомогенные везикулы, чем при отношении
5:1. С другой стороны, показано, что исходное отношение детергент/липид
может неблагоприятно сказаться на функциях реконструируемого белка.
Например, когда отношение детергент/липид настолько высоко, что
происходит вытеснение детергентом аннуллярных липидов, многие мембранные
белки необратимо инактивируются [33-35] (см. также разд. 2.3.2.).
От типа детергента, формирующего смешанные мицеллы, могут зависеть и
другие особенности реконструкции. Реконструкция методом холатного диализа
с использованием диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ) и АцХР в соотношении ф =
200 приводит к образованию незамкнутых фрагментов липидного бислоя
(размером 200 нм), в который внедрены плотно упакованные молекулы
рецептора. При замене холата на октилглю-козид получают осадок
агрегированного АцХР и липосомы, не содержащие белок (J. Earnest,
неопубликованные данные).
А. Реконструкция как процесс, обратный солюбилизации
'()
?
Реконструкция Зоно
Солюбилизация
Лизис
Смешанные мицеллы лигид-ашергрпт и белок-липид- детергент
Бислои
Замкнуть е Везикулы (симметричные)
5. Включение в заранее Сформированные Везикулы
Липидно-детергентные везикулы
Равновесие олигомер-Комплексы мономер
липид- детергент -белок
В. Различия в стабильности мииелл Комплексы Комплексы липид -
'белок теРгеит~ детергент - белок
О
Замкнутые Везикулы (асимметричные)
Липидные
везикцлы
Липидно- детергентнь/е смешанные мицеллы
Липидно- рислаи с Высокой
детергентные везикулы "латтстью 6ета
Рис. 5.4. Различные способы реконструкции мембран из солюбилизпрованн
компонентов прн удалении детергента (по данным обзора [59]).
224
Глава 5
3.3.3. Тип липида
Функциональная активность многих мембранных белков зависит от липидного
состава их окружения [32]. Включение белка при реконструкции в
определенное липидное окружение позволяет изучить специфическое влияние
липидов на функцию этого белка. Однако такие исследования необходимо
подкреплять тщательной характеристикой морфологии мембран, поскольку даже
незначительные изменения липидного состава могут сильно изменить
структуру реконструируемой мембраны. Ранние исследования по реконструкции
АцХР показали, например, что этот белок легко включается в азолектиновые
везикулы при холатном диализе, но когда в качестве липида был использован
фосфатидилхолнн, АцХР агрегировал, образуя цепи или кольца и не включаясь
при этом в липосомы [73]. Более того, АцХР включался в везикулы,
приготовленные (также путем холатного диализа) из суммарных липидов
рецепторных мембран, но осаждался без включения в везикулы, если
последние были приготовлены из липидов, лишенных холестерола [71]. Замена
диэлаидоилфосфатидилхолина (ДЭФХ, содержащий кислоту Сi8:i с г/дшс-
двойной связью) на ДОФХ (ФХ, содержащий кислоту Ci8:l с цпс-двойной
связью) приводит к изменению морфологии реконструированных мембран от
плоских бислойных фрагментов с равномерным распределением включенных
молекул АцХР до искривленных, напоминающих зонтик бислоев, в которых
молекулы АцХР расположены только по периферии. Если реконструированные
мембраны не просматривать под электронным микроскопом, то влияние липида
на морфологию мембраны можно неверно истолковать как его специфическое
воздействие на функцию белка.
Процесс реконструкции родопсина методом октилглюкозид-ного диализа тоже
зависит от липидного состава и от отношения липид/белок [55].
Делипидизированный родопсин (26мкМ) в октилглюкозиде (200 мМ) смешивали с
фосфолипидами при Ф = 300. Эксперименты проводили с яичным ФХ, ДОФХ,
ДМФХ, ПОФХ и липидами фоторецепторных дисков. Почти во всех случаях
конечное отношение липид/белок после удаления детергента составляло 30-
50, несмотря на то что исходно оно было равно 300. Исключение составляли
только случаи с ДМФХ. ДМФХ в отличие от других липидов имеет короткие и
насыщенные ацильные цепи. Как полагают авторы, смешанные мицеллы
октплглюкозида со всеми фосфолипидами, кроме ДМФХ, менее стабильны, чем
мицеллы из смеси октплглюкозид - фосфолипид- родопсин. Поэтому уже на
ранних стадиях диализа из-за избытка липида образуются везикулы, не
содержащие
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
225
белка. Белоксодержащие мицеллы, существенно не различающиеся по отношению
липид/белок, формируют везикулы на поздних стадиях диализа (рис. 5.4, Б).
3.3.4. Метод удаления детергента
Очень важной при реконструкции может оказаться скорость, с которой
удаляется детергент [74, 75], поскольку функциональная активность
некоторых мембранных белков изменяется при длительном воздействии
детергента. Скорость удаления детергента может сказываться и на структуре
реконструированных мембран. Если при реконструкции АцХР с азолектином,
ДОФХ или ДЭФХ при ф=10 000 холат удаляют диализом в течение 4 сут, то
