Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
поверхности скола, отвечающей наружной стороне бислоя, тогда как при
реконструкции в фосфатидилхолиновых везикулах он обнаруживается в равной
степени на обеих поверхностях скола. Эти исследователи предположили, что
векторная ориентация белка, наблюдаемая in vivo, не воссоздается при
реконструкции. Одинаковое распределение внутримембранных частиц на
вогнутой и выпуклой поверхностях скола послужило основанием для вывода о
том, что родопсин в яичном фосфатидилхолине не имеет векторной ориентации
[55]. Следует, однако, проявлять осторожность, применяя этот подход для
других белков и даже для родопсина, если условия реконструкции меняются.
Многие из тех белков, которые заведомо векторно ориентированы в мембране
эритроцитов, на поверхностях скола выглядят как хаотично распределенные.
К тому же изменения состава бислоя, гликозилирование или белок-белковые
взаимодействия могут привести к изменению характера распределения между
поверхностями скола (К. Fisher, личное сообщение).
Наконец, следует отметить, что при многих функциональных исследованиях
мембранных белков нет необходимости в том, чтобы все молекулы
исследуемого белка были экспонированы на наружной поверхности мембраны.
Например, в случае ацетилхолинового рецептора ионный канал открывается
при связывании агониста с наружным доменом белка, так что поток ионов
наблюдается только через те каналы, которые ориентированы соответствующим
образом [47].
3.4.4. Факторы, определяющие трансмембранную ориентацию белка
In vivo мембранные белки почти всегда имеют строго определенную векторную
ориентацию, однако при реконструкции они часто оказываются
ориентированными в бислое хаотически.
230
Глава 5
Известно, что на ориентацию белка при реконструкции влияет ряд факторов,
но на основании этих наблюдений пока трудно сделать какие-либо обобщающие
выводы.
Например, было показано, что поверхностный белок М13 включается в
димиристоилфосфатидилхолиновые везикулы так, что на наружной поверхности
бислоя находится только N-конец молекулы. Однако, если реконструкцию
проводить при температуре фазового перехода димиристоилфосфатидилхолина,
на наружной поверхности оказываются как N-, так и С-конец [90].
Ориентация может зависеть также от отношения липид/белок: при ф>88 Са2+-
АТРаза саркоплазматического ретикулума, реконструированная в везикулах из
липидов саркоплазматического ретикулума, имеет вполне определенную
ориентацию, тогда как при ф<88 этот белок ориентирован хаотически [88].
Гликофорин при реконструкции в фосфатидилхолиновых везикулах
ориентируется на 50-75% внешним доменом наружу [72, 80]. Однако при
низких отношениях липид/белок (ф=300) около 30% гликофорина не
встраивается в бислой, а захватывается везикулами [80]. Захваченный
везикулами гликофорин (а это наблюдается и в случае реконструированного
ацетилхолинового рецептора после замораживания - оттаивания; J. Earnest,
неопубликованные данные) может ошибочно восприниматься как белок, не
имеющий векторной ориентации. Этот пример говорит о том, что при
установлении трансмембранной ориентации белка необходимо применять
несколько методов, а для контроля за реконструкцией целесообразно
использовать электронную микроскопию.
На трансмембранной ориентации белков и липидов может сказываться также их
агрегация при реконструкции. Было показано, что молекулы белка,
образующего выступы на поверхности мембраны вируса леса Семлики, в
зависимости от концентрации октилглюкозида могут находиться в мономерном
либо олигомерном состоянии [59]. Если при реконструкции с яичным
фосфатидилхолином белок находится в олигомерной форме, то 95% его молекул
оказываются экспонированными на наружной поверхности везикул, тогда как
при реконструкции белка в мономерной форме доля молекул, имеющих наружную
ориентацию, составляет всего 70%. Гипотеза, объясняющая эти наблюдения на
молекулярном уровне, представлена на рис.
5.4, А и Б. Результаты этих экспериментов, как и данные Кэрролла и
Рэкера [83], показывают, что если необходимо добиться векторной
ориентации белка при реконструкции, то лучше всего включать его в заранее
сформированные везикулы.
При тех соотношениях липид/белок, которые способствуют формированию
замкнутых везикул (в области ф = 1000), от 75 [85] до 95% [77] молекул
реконструированного ацетилхоли-
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
231
Таблица 5.8. Включение ацетилхолинового рецептора в липидные везикулы
1. Суспендируют 600 мг азолектина1' в 10 мл буфера БД-1. Обрабатывают
суспензию при комнатной температуре ультразвуком до получения достаточно
однородной суспензии (10-30 мин). Добавляют холат натрия в виде порошка
(0,4 г) до концентрации 4% и снова обрабатывают ультразвуком до тех пор,
пока раствор не станет прозрачным (10 мин).
2. Если необходимо, буфером БД-3 (табл. 5.6) доводят раствор очищенного
ацетилхолинового рецептора до концентрации по белку 1,5 мг/мл. (В
зависимости от числа собранных фракций концентрация белка может быть
