Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
3. Проводят анализ образцов.
а. К 50 мкл охлажденного во льду мембранного образца добавляют 10 мкл
IFA-1/Carb илн IFA-1/Buff.
б. Инкубируют в течение 30 с.
в. Отбирают 50 мкл и сразу же наносят на колонку со смолой дауэкс.
г. Сразу после того, как раствор впитается в смолу, добавляют 3 мл 175 мМ
сахарозы. Собирают элюат непосредственно в сцинтилляционный флакон.
д. Просчитывают флаконы в сцинтилляционном счетчике.
Каждый образец необходимо анализировать по меньшей мере дважды - в при-су
тствги и в отсутствие агониста. Колонки можно повторно использовать два
или три раза без дополнительной обработки.
е. Стандарты: добавляют 10 мкл буфера IFA-1/Buff к 1 мл воды и
просчитывают аликвоты по 10 мкл.
к. Фон: добавляют 50 мкл буфера БД-1 вместо мембранного препарата в одной
серии определений.
з. Внутренний объем: инкубируют 200 мкл мембран с 40 мкл буфера IFA-
1/Carb или IFA-1/Buff в течение 36-48 ч. Затем пропускают аликвоты по 50
мкл через колонку4 с дауэксом, как описано выше.
¦) Вместо карбамилхолина можно использовать другие агонисты.
рецептор агонистом еще до добавления меченых катионов, можно
зарегистрировать кинетику инактивации канала.
Другой метод (рис. 5.7) основан на совершенно ином принципе. Если в
замкнутые везикулы ввести флуоресцентный краситель, то при проникновении
в них ионов тяжелых одновалент-
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков____________ 245
яых металлов будет происходить тушение флуоресценции. Раф-тери и др.
[110] методом остановленной струи регистрировали проникновение ионов
таллия в везикулы, в которые с помощью процедуры замораживания -
оттаивания был включен флуоресцентный краситель. Кинетика тушения
флуоресценции зависит от скорости проникновения одновалентных ионов
внутрь везикул. Успешность применения данного подхода, как и методики,
предложенной Хессом и др. fill], связана с тем обстоятельством, что
ионный канал ацетилхолинового рецептора легко проницаем почти для всех
одновалентных катионов.
4.2.2. Потенциалзависимые каналы
Более сложные проблемы возникают при регистрации ионных потоков через
потенциалзависимые каналы, например через натриевые и кальциевые. В этом
случае полностью реконструированной следует считать систему, в которой
можно не только генерировать трансмембранный потенциал, но и менять его
контролируемым образом. Пока никому не удалось провести реконструкцию
так, чтобы полностью имитировать поведение нативного белка. Однако
имеются токсины (например, вератри-дин), которые селективно связываются с
натриевым каналом и фиксируют его в открытом состоянии. Ряд
исследователей показали, что с помощью комбинации методов анализа
связывания токсинов и регистрации ионных потоков можно осуществить
функциональную реконструкцию очищенного натриевого канала в везикулах
[112].
4.3. Общие замечания
Методы, описанные выше, можно применять практически ко всем мембранным
системам, в которых осуществляется перенос веществ через мембрану.
Основным лимитирующим фактором здесь, по-видимому, является целостность
мембранных везикул. Даже если реконструкция приводит к образованию
везикул с невекторной трансмембранной ориентацией белка, можно проводить
регистрацию его активности в векторных условиях, вводя требуемый субстрат
(или субстраты) только с одной стороны мембраны. Осложнения могут
возникнуть в том случае, если транспортируемое вещество связывается с
мембраной. Например, такие двухвалентные катионы, как кальций,
связываются с довольно высоким сродством и с липидами, и с белками.
Поэтому при измерении кальциевых потоков приходится проводить специальные
эксперименты, чтобы ввести поправки на неспецифическое связывание.
246
Глава 5
С помощью комбинации методов анализа связывания лигандов, определения
ферментативной активности и регистрации проницаемости/транспорта удается
получать полезную количественную информацию о структуре и функциях многих
мембранных белков как в солюбилизированном, так и в мембраносвязанном
состоянии.
5. Новые возможности применения реконструированных мембран
Методы солюбилизации и реконструкции не только позволяют изучать
функциональную активность белков; они могут оказаться очень полезными и
при установлении структуры белковых молекул. Пожалуй, наиболее
показательным примером в этом отношении является получение упорядоченных
мембранных препаратов, пригодных для анализа третичной структуры белка.
5.1. Использование реконструированных мембран для изучения структуры
белков
Структурные данные о мембранных белках с разрешением, необходимым для
установления пространственного расположения полипептидной цепи, можно
получить только с помощью дифракционных методов. Эти методы требуют
наличия регулярно повторяющихся белковых структур. С помощью методов,
основанных на дифракции света или электронов, можно изучать лишь
двумерные мембранные кристаллические решетки, да и то при низком
разрешении [ИЗ]. Для рентгеноструктурного же анализа высокого разрешения
