Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 96

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 90 91 92 93 94 95 < 96 > 97 98 99 100 101 102 .. 191 >> Следующая

помощью аффинной хроматографии
Для мембранного препарата, выделенного из 200 г ткани, пригодна колонка
объемом 25 мл. Описанная ниже методика рассчитана на колонку объемом 50
мл, так как фирма Bio-Rad поставляет смолу аффигель 401 партиями по 50
мл. Эту методику можно модифицировать для проведения очистки в меньшем
масштабе.
1. К 50 мл аффнгеля (Bio-Rad), помещенного в колонку размером 1,5X20
см типа Econo-Column (Bio-Rad), добавляют 50 мл 20 мМ дитиотреитола (ДТТ)
в 0,1 М трис-буфере, pH 8,0. Хорошо перемешивают и оставляют на 20 мин1*.
Сслкбн.иьапия и реконструкция мембранных бел ов
213
2. Промывают колонку водой, чтобы удалить ДТТ. Анализируют гель и
последнюю порцию промывающего раствора на присутствие сульфгндрнльных
групп (см. ниже). Их содержание в этом растворе должно быть на уровне
фона.
3. Добавляют к гелю, находящемуся в колонке, равный объем буфера,
содержащего 100 мМ NaCI и 50 мМ фосфат натрия, pH 7. Хорошо перемешивают,
добавляют 300 мг бромацетилхолнна и сразу же перемешивают суспензию геля
встряхиванием. Оставляют реакционную смесь на 30 мин, периодически
встряхивая. (Высокая концентрация фосфата необходима для поддержания pH
7.) Получение бромацетилхолнна описано в конце таблицы.
4. Промывают колонку водой и проводят анализ геля на содержание свободных
сульфгндрнльных групп. Их содержание в геле должно быть очень низким.
Если необходимо, повторяют обработку бромацетнлхолином.
5. Добавляют 50 мг иодацетамнда, чтобы произошло алкилированне всех
оставшихся сульфгидрильных групп и был подавлен рост микроорганизмов.
Хранят колонку до тех пор, пока она не понадобится.
6. Колонку можно использовать несколько раз (обычно три раза в течение 3-
4 нед). Чтобы свести гидролиз лиганда к минимуму, колонку заполняют
буфером с низкой ионной силой при pH 4. Если выход очищенного ацетил-
холинового рецептора становится ниже 50% от оптимального, пора готовить
новую колонку.
Анализ на сульфгидрильные группы
1. Готовят исходный 10 мМ раствор дитнонитробензоата (ДТНБ) и хранят его
в замороженном состоянии (39,6 мг на 10 мл, осторожно титруют NaOH до pH
7).
2. Добавляют 0,33 мл 10 мМ ДТНБ к 10 мл 0,1 М трис-буфера, pH 8,0.
3. К 50 мкл геля или к 50 мкл элюата добавляют 1 мл разбавленного
раствора ДТНБ. (Чтобы пластмассовый наконечник микропипетки не забивался
сгустками геля, срезают его кончик.)
Качественную оценку можно проводить по изменению окраски; восстановленный
гель имеет ярко-желтый цвет. После иммобилизации бромацетилхолнна гель не
должен окрашиваться. Количественный анализ можно проводить, измеряя
оптическую плотность при 412 нм дтя взвешенного образца геля, нз которого
отсасыванием удален избыток буфера. Однако в большинстве случаев
достаточно качественной реакции.
Получение бромацетилхолина К 18,4 г (0,1 моля) твердого холинбромнда
добавляют по каплям прн постоянном перемешивании 24,2 г (0,1 моля)
бромацетилбромида. Реакционную смесь выдерживают в течение 40 мин. Вязкую
смесь охлаждают в ледяной бане и перемешивают еще 75 мин. Затем к смеси
медленно добавляют 75 мл абсолютного этанола. Белый кристаллический
осадок отфильтровывают при отсасывании. Прн перекристаллизации из 400 мл
нзопропанола получают кристаллы с температурой плавления 136-138 °С.
Выход обычно составляет 24 г
*) Эта операция проводится для того, чтобы гарантировать перевод геля в
восстановленное состояние, однако она не является обязательной. Ее, как н
последующие стадии, можно проводить в пробярке или в стакане. По нашему
мнению, все операции удобно проводить прямо в колонке.
2.4. Солюбилизация и очистка никотинового ацетилхолинового рецептора из
Torpedo californica
В качестве иллюстрации к общим правилам, рассмотренным выше, в табл. 5.5,
5.6 и 5.7 детально описан процесс очистки ацетилхолинового рецептора
(АцХР) Torpedo. Обычно из 200 г
214
Глава 5
электрических пластинок можно получить приблизительно 20 мг очищенного
АцХР. Обратите внимание, что липиды специально добавляют в детергентный
раствор на стадии аффинной хроматографии. Если липиды исключить, очистка
протекает нормально, но выделенный препарат АцХР не дает функционально
активные ионные каналы при последующей реконструкции.
3. Общая стратегия реконструкции мембранных белков
В идеале конечный продукт реконструкции должен представлять собой
суспензию моноламеллярных везикул одного размера, имеющих одинаковое
соотношение липид/белок. Везикулярный бислой должен иметь такую же
проницаемость, как и нативная мембрана: везикулы должны сохранять
захваченные непроникающие ионы или молекулы и иметь достаточный
внутренний объем, чтобы можно было измерить содержание захваченных ими
веществ. Везикулы не должны содержать остаточного детергента. Мембранные
белки должны быть ориентированы и встроены в бислой таким же образом, как
и в нативной мембране. Бислой должен иметь такой состав, который
необходим для сохранения функциональной активности, присущей нативному
Предыдущая << 1 .. 90 91 92 93 94 95 < 96 > 97 98 99 100 101 102 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed