Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
ККМ прямо и косвенно связана с реконструкцией. Например, концентрация
детергента, вызывающая солюбилизацию, зависит от действия тех же
факторов, которые влияют на величину ККМ (см. ниже). Косвенная связь
проявляется в том, что детергенты с более высокой ККМ легче удаляются
диали-
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
207
Таблица 5.4. Коммерческие препараты радиоактивно меченных детергентов и
поставляющие их фирмы
Детергент Метка Цена') долл. США за 1 мкКи Источник )
ДСН 35S 0.8 Ат
"С 4,5 RPI
Холат 3Н 0,5 MEN
'С 4,0-6,3 Am. NEN, RPI
Дезоксихолат 14с 3,4-5,8 Am, ICN
Лпзо-ФХ (Сю) нс 16,7-33,5 Am, NEN
Октплглюкозид 14с 1,0(r) ARC3"
С^Ев ,4С 5,0 RPI
Тритон Х-100 Зн 1,0 NEN
Твин 80 14с 2,80 PRI
*) Цены приведены по каталогам за 1985-1986 гг. и являются
приблизительными.
2) Условные обозначения: Am - Adnersham Radiochemicals; NEN - New
England Nuclear; RPI - Research Products International; ARC - American
Radiolabeled Chemicals.
3) Синтез октилглюкозида осуществляется по заказу. По последней заявке
стоимость 4 мКи составила 4000 долларов. Фирма American Radiolabeled
Chemicals поставляет ре< активы по заказам намного дешевле, чем другие
компании.
зом, чем детергенты, имеющие низкую ККМ. Удаление детергента является
ключевой стадией реконструкции и будет рассмотрено в разд. 3. ККМ
некоторых детергентов, широко применяемых при реконструкции, приведены в
табл. 5.1 (более подробные данные см. в работе [27]).
ККМ зависит от многих факторов. Наиболее существенное влияние оказывают
изменения в полярной и в неполярной областях детергентной молекулы [25].
ККМ снижается при увеличении размера неполярной области. Этой тенденции
противодействуют такие изменения структуры, которые нарушают упаковку
молекул детергента. Например, наличие двойных связей млн разветвлений в
углеводородной цепи способствуют возрастанию ККМ. Нарушения упаковки
происходят и при модификации полярной области молекулы.
Электростатическое отталкивание между полярными группами заряженных
детергентов увеличивает их ККМ приблизительно в 100 раз по сравнению с
соответствующими незаряженными аналогами [25]. Увеличение ионной силы
раствора приводит к снижению ККМ, особенно в случае ионных детергентов
[28]. Повышение температуры слабо влияет на ионные детергенты (выше
критической температуры мицеллообразования), но приводит к заметному
снижению ККМ неионных детергентов, вероятно, за счет усиления гидрофобных
взаимодействий [7, 21, 24].
При увеличении концентрации детергента в растворе до величин, намного
превышающих ККМ, размер мицелл растет до
208
Глава 5
тех пор, пока они не начнут агрегировать и выпадать в осадок.
Температура, при которой это происходит, называется "точкой помутнения".
Такую особенность поведения детергентов можно использовать для
солюбилизации и очистки некоторых мембранных белков. Тритон Х-114,
например, имеет точку помутнения примерно 20 °С. Мембранные белки,
солюбилизированные тритоном Х-114 при 0СС, будут осаждаться при 20 СС,
что дает возможность осуществить в одну стадию их избирательную
солюбилизацию и частичную очистку [29J. Описание этого методического
приема дано в разд. 2.2.1 гл. 6.
2.3. Факторы, влияющие на стабильность солюбилизированных мембранных
белков
2.3.1. Соотношение липид - детергент - белок
Константы связывания детергента с мембраной трудно измерить из-за
неидеальности смеси, поэтому не удается и напрямую связать величину ККМ
детергента с его способностью взаимодействовать с липидно-белковыми
мембранами и вызывать их солюбилизацию [8]. Однако трудности точного
математического описания процесса солюбилизации не помешали развитию
методов реконструкции, а накопленный при этом практический опыт был
использован для разработки полуколичест-венных подходов.
В большинстве случаев перед исследователем стоит задача добиться
максимальной солюбилизации белка и сохранить при этом его функциональную
активность. Наиболее эффективный путь для достижения этой цели состоит в
том, чтобы изучить процесс солюбилизации в широком диапазоне отношений
детергент- липид, и такие эксперименты следует рассматривать как
необходимый этап любой работы по солюбилизации/реконструкции мембран.
Обычно легче измерить концентрацию белка, чем липида, поэтому в
литературе часто указывают отношение детергент/белок. Поскольку степень
солюбилизации зависит как от концентрации липида, так и от концентрации
детергента в мицеллярном состоянии, было бы полезно ввести некий
параметр, характеризующий эффективную концентрацию детергента. В
последнее время было предпринято несколько таких попыток. Наибольший
интерес вызывает параметр р, предложенный в работе [26]:
[Детергент! - ККМ
р =--------:-----------,
[Фосфолипид]
где ККМэфф означает ККМ, измеренную при определенных экспериментальных
условиях. Введение ККМэфф вместо просто
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
209
ККМ объясняется тем, что последняя часто снижается в присутствии липидов
