Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
7.7). Чтобы оценить мембранный потенциал с использованием нулевой точки
по pH, необходимо знать pH внутри клетки (обычно он близок к 7,1),
который в свою очередь можно определить с помощью индикаторов pH (см.
ниже).
3.3. pH клеточных компартментов
3.3.1. pH эндосом
Большинство эукариотических клеток путем эндоцитоза поглощает компоненты
собственной плазматической мембраны и связанный с ней экзогенный
материал. Дальнейшая судьба эндосом может быть довольно сложной, но
обычно их превращения включают этап, на котором происходит повышение pH
внутривезикулярной среды [35]. pH внутри таких эндосом можно прямо
измерить, если присоединить pH-чувствительный краситель либо к
соответствующему участку мембраны, либо к подходящему экстраклеточному
компоненту, захватываемому при эндоцитозе. Для этой цели чаще всего
используют флуорее-цеин, поскольку он хорошо виден во флуоресцетный
микроскоп, а его изотиоцианатное производное можно ковалентно пришить к
аминогруппам белков (для опосредуемого рецептором эндоцитоза) или к
декстрану. Кроме того, флуоресценция свободного и связанного флуоресцеина
чувствительна к pH в диапазоне от 4,5 до 7,5 [18]. Инкубируя клетки в
подходящей физиологической среде с красителем, можно наполнить эндосомы
производными флуоресцеина, а затем освободиться от экстракле-точного
красителя отмыванием (табл. 7.3). Процедура калибровки флуоресценции
представлена на рис. 7.8, Л: после измерения интенсивности флуоресценции
устанавливают pH всех клеточных компартментов на уровне, равном pH среды,
добавлением ионофора моненсина; затем постепенно уменьшают pH среды до
тех пор, пока интенсивность флуоресценции не станет равной исходной.
Значение pH среды, при котором это происходит, равно начальному pH внутри
эндосомы. Основная трудность данной методики связана с флуоресценцией
самих клеток, которая тоже может оказаться рН-зависимой.
Более точную оценку pH внутри эндосом можно получить, следя за
распределением проникающих в эндосомы аминов, например 9-аминоакридина
или акридинового оранжевого, флуо-
Оптическая спектроскопия биологических мембран
329
l.gCK V 8 среде (•)
pH среды •)
Рис. 7.7. А Измерение мембранного потенциала лимфоцитов с помощью оксо-
иола-V. Лимфоциты суспендировали до концентрации 107 клетка/мл в среде,
содержащей 150 мМ NaCI, бмМКС1, 5mMHEPES, lMMMgCl2, 2-10-6Моксо-нол-V, pH
доводили до 7,4 раствором NaOH при 37 °С. ФКФ и NaOH или НС1 (верхняя
кривая) либо валиномиции и КС1 (иижняя кривая) добавляли до указанных
конечных концентраций илн pH. Б. Зависимость от pH разности между
поглощением оксоиола-V до н после добавления ФКФ (квадратики) и
зависимость от концентрации К+ изменений поглощения до и после добавления
валиномицина (кружки). Концентрации Н+ и К+, при которых добавление ФКФ
или валиномицина соответственно ие приводит к изменениям поглощения,
определяют в точках пересечения кривых с базовой линией (пунктир). В
данном случае "нулевая точка" по К+ составляет 11 мМ, а по pH -7,91;
внутриклеточная концентрация К+ равна 102 мМ, а pH -7,0; следовательно,
мембранные потенциалы равны соответственно -59 и -56 мВ. (Из работы [21)
с разрешения авторов.)
330
Глава 7
1DD
А НС1
рН?\
НС1
рнб\
нсг
рщ\
Моненсин
pHk
Трис НС1
\ I
рН8
PH7.3
Тритон
+ЗГ7А
+ЭДТА
HCL
{
рН7 j
I рНБ
ЭГТА 1мМ }
Са'
1 ЭГТА
\ j ЭГТА !Ц?ннМ i \ Саг* 1 I--I DJMHM i.Ca'-t....
Тоитон
I
\<1nM
\Ca2*
Рис. 7.8. Калибровка внутриклеточных зондов pH и Са2+. А. Клетки,
окрашенные флуоресцеииом/декстраном (табл. 7.3; [18]), суспендировали в
уравновешенной солевой среде Хенка, содержащей 20 мМ HEPES, pH 7,0
(NaOH). Для возбуждения флуоресценции использовали свет с дтииой волны
493 им (ширина щели 6 нм), а регистрировали флуоресценцию при 520 нм
(ширина щели 10 им) в режиме "отношение" на флуориметре Perkin-Elmer
MPF4. Для калибровки исходного сигнала (6 единиц) вначале добавляли
моненсин до конечной концентрации 1 мкг/мл, чтобы выровнять pH всех
компартментов системы [18], а затем последовательными добавлениями НС1
доводили pH суспензии до указанных значений. Исходная интенсивность
флуоресценции клеток восстанавливалась в присутствии моненсина прн pH
4,8, т. е. флуорес-цеин/декстран локализован в компартменте с pH 4,8. Все
сигналы необходимо скорректировать с учетом флуоресценции неокрашенных
клеток, а также измерить флуоресценцию супернатанта (в данном случае она
оказалась пренебрежимо малой, <10% от флуоресценции в присутствии
клеток). Б. Тимоциты, окрашенные квеиом-1 (табл. 7.4; [9]),
суспендировали до концентрации 5-106 клетка/мл в культуральной среде RPMI
1640 (без фенолового красного) с добавлением глюкозы (11 мМ) и HEPES (10
мМ), pH 7,3 (NaOH), температура 37 °С. Флуоресценцию возбуждали светом с
длиной волны 390 нм (ширина щелн 10 им) и регистрировали при 530 нм
(ширина щели 10 им) на спект-рофлуориметре Perkin-Elmer 44В. Для
калибровки сигнала (49 единиц) клеточную мембрану разрушали 0,05%-иым
