Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 152

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 146 147 148 149 150 151 < 152 > 153 154 155 156 157 158 .. 191 >> Следующая

концентрации красителя [4]. pH цитоплазмы клеток Леттре в таких условиях
был равен
7,01. Мы предполагали, что p/fa и спектральные свойства ассоциированного
с клетками красителя идентичны свойствам свободного красителя. Это
предположение еще предстоит проверить. Однако полученное нами с помощью
индикаторов значение pH неплохо согласуется с pH, полученным двумя
независи-
Длина волны, нм
Рис. 7.9. Измерение pH клеток Леттре с помощью нейтрального красного. На
сканирующем двухволновом спектрофотометре (Applied Photophysics Ltd.,
London) регистрировали и записывали в цифровой памяти компьютера спектры
поглощения четырех образцов: (I) спектр среды, содержащей 150 мМ NaCI, 5
мМ КС1, 5 мМ HEPES, 1 мМ MgS04, pH 7,3, используемый как базовая линия
для спектра 2; (II) спектр среды, содержащей 3-106 клеток Леттре в 1 мл,
используемый как базовая линия для спектра 1; (III) спектр среды,
содержащей 3• 10б клеток в 1 мл и 4-10~5 М нейтральный красный; (IV)
спектр супернатанта, образовавшегося после центрифугировании среды III в
течение 1 мин при 16 ООО g в бекмановской микроцентрифуге В. Представлены
следующие разностные спектры: спектр 7 = 111 - 11, спектр внеклеточного и
внутриклеточного нейтрального красного; спектр 2=IV- I, спектр
внеклеточного нейтрального красного; спектр 5=(Ш - II) - (IV- I), спектр
внутриклеточного нейтрального красного (представляет собой разность
спектров 1 и 2). pH внутри и снаружи клеток вычисляли из отношения
поглощения при 530 им к поглощению при 477 им [4]. Для спектра 2 (внешний
объем) Л53о/Л47;-=0,768, рН= =7,32. Для спектра 3 (внутриклеточное
пространство) Л530/Л477= 1,032, рН=7.01.
Оптическая спектроскопия биологических мембран
335
мыми методами, а именно - с помощью 3,Р-ЯМР и по данным о направлении
утечки катионов из клеток, проницаемость которых индуцировали вирусом
Сендай [37].
3.4. Поверхностный потенциал мембран
Обычно биологические мембраны несут суммарный отрицательный заряд из-за
присутствия на поверхности липидных и белковых молекул кислых групп
(фосфатных, сульфатных, карбоксильных). Абсолютное значение
отрицательного заряда (поверхностного потенциала) прямо определить
невозможно, но электрофоретические измерения [38-40] позволяют оценить
дзета-потенциал, равный разности потенциалов между границей подвижной
части двойного электрического слоя и водной фазой, а также поверхностную
плотность зарядов. Экспонированные на поверхности мембраны ферменты и
рецепторы прямо или опосредованно, через взаимодействие с
адсорбированными катионами, могут "чувствовать" изменения поверхностного
потенциала.
В качестве зондов для измерения поверхностного потенциала мембран
использовали несколько хромофоров. Идея эксперимента предельно проста.
Амфифильный хромофор будет связываться с гидрофобными сайтами на
поверхности клетки. Изменение окружающего хромофор растворителя прямо
влияет на спектр флуоресценции и поглощения, поэтому свободный и
мембраносвязанный красители можно различить оптическими методами. А если
краситель заряжен, то поверхностный потенциал будет непосредственно
влиять на сродство красителя к мембране (положительно заряженные зонды
связываются сильно, отрицательно заряженные - слабо). При изменении
поверхностного потенциала сродство красителя к поверхности будет
меняться, что несложно зарегистрировать по изменению его оптических
свойств. Так, в качестве зонда, чувствительного к изменениям
поверхностного заряда мембран хлоропластов, использовали 9-аминоакридин
(положительно заряженный краситель) [19, 41]); флуоресценция связанного с
мембраной красителя пренебрежимо мала. 1-анилино-8-нафталинсульфонат
(АНС, отрицательно заряженный краситель) применяли при исследовании
митохондриальной и других мембран [42-44]; в данном случае свободный
краситель обладал крайне низкой интенсивностью флуоресценции. Уменьшение
поверхностного потенциала приводило к разгоранию флуоресценции 9-
аминоакридина (высвобождение слабо флуоресцирующего связанного красителя
в среду) и АНС (связывание красителя с мембраной, приводящее к увеличению
квантового выхода флуоресценции) .
336
Глава 7
Недостаток рассмотренных методов состоит в том, что флуоресценция этих
красителей чувствительна ко многим факторам, например к трансмембранному
распределению зондов, и доказать, что регистрируется только поверхностный
потенциал, крайне трудно. Кроме того, в отличие от трансмембранного
потенциала, который с помощью ионофоров можно изменить на заранее
заданную величину, поверхностный потенциал невозможно модулировать столь
же простым способом; это не позволяет осуществить точную калибровку
сигнала.
4. Перспективы
Элегантность и простота оптических экспериментов позволяют надеяться, что
фотометрические и флуориметрические методы изучения функций мембран
получат дальнейшее развитие. Число работ, посвященных исследованию
поведения индивидуальных клеток в сложных надклегочных системах,
возрастает. Так, оптические зонды, чувствительные к мембранному
Предыдущая << 1 .. 146 147 148 149 150 151 < 152 > 153 154 155 156 157 158 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed