Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
тритоном Х-100 в присутствии 0,5 мМ ЭГТА н 0,5 мМ ЭДТА (эти хелатирующие
агенты уменьшают концентрацию свободных Са2+ и Mg2+ до уровня, при
котором они не оказывают влияния на pH-зависимую флуоресценцию квеиа-1
[9] и предотвращают тушение фтуоресценции ионами каких-либо других
металлов). После обработки тритоном в среду высвобождается более 90%
красителя, который можно оттитровать с помощью трис и НС1 (значения pH
указаны над кривыми). Интенсивности флуоресценции до и после добавления
тритона совпадают при pH 7,1; следовательно, при pH среды 7,3 pH
цитоплазмы составляет 7,1. В. Окрашенные квином-2 лимфоциты (табл. 7.4;
[8]) суспендировали до концентрации 5-10s клетка/мл в среде, содержащей
130 мМ К.С1, 20 мМ NaCI, 1 мМ СаС12,
1 мМ MgCI2, 5 мМ глюкозу, 10 мМ MOPS, pH 7,4 (NaOH). Флуоресценцию
возбуждали светом с длиной волны 339 нм (ширина щели 4 нм) н
регистрировали при 500 нм (ширина щели 10 им) на спектрофлуориметре
Perkin-Elmer MPF 44В. Для калибровки сигнала увеличивали проницаемость
клеток с помощью 0,05%-иого тритона Х-100, а затем титровали среду ЭГТА,
MgCl2 и КОН, доводя концентрацию Са2+ до 0,2 и 0,1-10-6 М, как указано
над кривой, в присутствии 1 мМ свободного Mg2+, pH 7,05 [8]. "Нулевая
точка" по
Оптическая спектроскопия биологических мембран
331
ресценция которых зависит от концентрации. Эти амины накапливаются в
компартментах с кислым содержимым, поскольку протонированная форма
красителя значительно хуже проходит через мембрану, чем свободное
основание. Если происходит быстрое установление равновесия по
непротонированной форме красителя между содержимым эндосомы и средой, то
pH внутри везикулы определяется следующим соотношением [7]:
рНв = рН"-1е([АН+]в/[АН+]"). (3)
В норме рНн<рА-1, поэтому [АН+] ^ [АН+] + [А]. 10 мМ раствор 9-
аминоакридина флуоресцирует в желтой области спектра [4], а акридиновый
оранжевый - в красной, но не в голубой области (низкие концентрации
красителя). В клетках, инкубированных с 0,01 мМ 9-аминоакридином, под
флуоресцентным микроскопом наблюдается множество желтых везикул; это
везикулы, в которых концентрация красителя по крайней мере на два порядка
выше, чем в среде, а значит, pH в них должен составлять ~5-6.
3.3.2. pH или [Са2+] в цитоплазме или в изолированных мембранных
везикулах
С помощью "пойманных в ловушку" красителей можно также измерять pH или
концентрацию ионов кальция в цитоплазме или в изолированных
компартментах. Для этой цели удобны индикаторы типа квен-1 [9] или квин-2
[8].
1. Нагружают клетки красителем. Для этого добавляют аце-токсиметиловый
эфир красителя, который проникает через плазматическую мембрану в
цитоплазму, где затем гидролизуется клеточными эстеразами до
непроникающей кислой формы (табл. 7.4).
2. Следят за ходом деэтерификации по постепенному изменению спектра
флуоресценции, а именно - по исчезновению флуоресценции эфира и
параллельному появлению флуоресценции кислоты. При этом важно
поддерживать pH цитоплазмы вблизи 7, где активность эстераз оптимальна.
Кроме того, поскольку при гидролизе образуется кислота, лучше всего
включать в инкубационную среду бикарбонаты [9].
3. По окончании инкубации промывают клетки, чтобы флуоресценция среды
уменьшилась до минимума. Наблюдающаяся после этого флуоресценция связана
с красителем, находящимся в цитоплазме. Слишком интенсивное отмывание
может при-
Са2+ (<1 нМ) достигается при концентрации ЭГТА 2 мМ и рН>8,3. Каждый раз
учитывали вклад флуоресценции неокрашенных клеток и не разрушенных
тритоном лимфоцитов. Содержание внутриклеточного Са2+ составило 150 иМ.
Все кривые на этих рисунках построены по данным работ [8, 9, 18].
332
Глава 7
Таблица 7.3. Окраска эндосом производными флуоресценна
1. Клетки инкубируют при 37 °С в культуральной среде, содержащей
производные флуоресценна (концентрация ~1 мг/мл). Молекулы красителя
быстро
(-10 мии) проникают в клетки, а затем поглощаются вторичными лизосома-ми
[35]. При температурах ниже физиологических эндоцитоз и внутриклеточный
мембранный транспорт сильно замедляются. При 4°С происходит только
связывание лигандов с клеточной поверхностью, поэтому при низкой
температуре можно "насытить" рецепторы молекулами красителя, а затем,
повысив температуру, "включить" эндоцитоз.
2. Внеклеточный краситель удаляют промыванием клеток холодной (4°С)
культуральной средой. За наблюдающуюся после этого флуоресценцию
ответствен краситель, локализованный в клетках.
3. Окрашенные клетки помещают во флуоресцентный микроскоп или флуори-метр
и измеряют интенсивность флуоресценции. Флуоресценцию прикрепленных к
твердому субстрату клеток можно исследовать с помощью световодов (рис.
7.1) либо стандартного флуориметра, поместив пластинку с субстратом по
диагонали во флуоресцентную кювету (полученная конструкция напоминает
оптическую систему, используемую для регистрации флуоресценции
непрозрачных или сильно поглощающих образов). При этом важно во время
