Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
энергозависимых процессах [11].
2.3. Характеристика и калибровка оптических сигналов
После выбора хромофора и системы необходимо охарактеризовать их
оптические свойства. Во-первых, в спектре хромофора (поглощения или
флуоресценции) in situ могут появиться дополнительные полосы, которые
будут ограничивать возможности эксперимента. Во-вторых, такие
предварительные исследования позволяют установить отношение сигнала к
шуму для тех характеристик, которые предполагается измерять (шум
понимается в самом общем смысле).
К сожалению, при калибровке оптических сигналов (будь то измерение pH,
трансмембранного потенциала или концентрации катиона) обычно приходится
разрушать экспериментальную систему. Например, ионофоры необратимо
изменяют мембранный потенциал в процессе калибровки сигнала индикаторных
красителей. Аналогично, провести калибровку сигнала индикаторов
внутриклеточного pH или Са2+ можно только после того, как мембрана
сделана полностью проницаемой. Лишь после проведения соответствующей
калибровки можно приступать к прямому изучению системы.
2.4. Артефакты
Оптические исследования биологических мембран таят в себе много
неожиданного, и прежде чем приступать к интерпретации экспериментальных
данных, необходимо провести самые строгие и тщательные контрольные опыты.
Артефакты чаще всего встречаются при флуоресцентных измерениях.
Рассмотрим те из них, которые наиболее легко устранимы.
2.4.1. Паразитный свет и мутные растворы
Понятие "паразитный свет" относится к любому попавшему на детектор свету,
который либо не связан с флуоресценцией, либо - если речь идет об
измерении поглощения - имеет
316
Глава 7
длину волны, отличную от заданной. Это может быть свет, попавший в прибор
снаружи, или побочный свет, прошедший от источника через монохроматоры и
фильтры. Долю паразитного света можно уменьшить, если правильно
сконструировать прибор, выбрать нужные фильтры (чтобы исключить дифракцию
более высокого порядка и зеркальное отражение от решетки монохроматора) и
работать в темной комнате.
Суспензии биологических мембран мутные. В этом случае особенно важно
отдифференцировать вклад рассеянного света. Поскольку рассеянный свет по
своей интенсивности значительно превосходит флуоресценцию, необходимо
тщательно подбирать фильтры и ширину щелей, чтобы измерять только
флуоресценцию [12]. Важно помнить, что если в суспензии мембранных
везикул происходит резкое изменение осмолярности или в среду вводятся
проникающие через мембрану соли, то может произойти значительное
изменение мутности суспензии, а следовательно, и интенсивности
флуоресценции или поглощения [13]. Чтобы "уловить" как можно больше
высвеченных или прошедших через образец квантов света, кювету обычно
помещают максимально близко к детектору.
Мутные растворы оказываются предпочтительными, еслн хромофор имеет низкий
коэффициент экстинкции или может использоваться только при очень низких
концентрациях. Это связано с тем, что в результате многократного
отражения света от частиц суспензии значительно увеличивается эффективная
длина оптического пути при измерении поглощения, а следовательно, и доля
поглощенного света (следствие закона Ламберта- Бэра). В этом случае
большие преимущества дает использование двухволнового режима регистрации,
когда измеряется поглощение при одной длине волны относительно поглощения
при второй, слегка отличающейся длине волны, в одной кювете. Изменения
мутности суспензии в равной мере влияют на поглощение при обеих длинах
волн и, следовательно, нивелируются [4, 14].
2.4.2. Неадекватное возбуждение
Возбуждающий свет может поглощаться нефлуоресцирующн-ми компонентами
системы; такая проблема возникает, например, при регистрации
поверхностной флуоресценции тканей и органов. Так, кровь полностью
поглощает свет, используемый для возбуждения флуоресценции
пиридиннуклеотидов и флаво-протеинов. При увеличении количества крови в
поле зрения (например, вследствие расширения сосудов) уменьшается
интенсивность флуоресценции, и можно прийти к ошибочному выводу об
изменении окислительно-восстановительного состоя-
Оптическая спектроскопия биологических мембран
317
ния митохондрий. Для решения этой проблемы нужно измерять отношение
интенсивностей флуоресценции пиридиннуклеотидов (PN) и флавопротеинов
(FP): при восстановлении митохондрий интенсивность флуоресценции PN
увеличивается, a FP уменьшается, при окислении же наблюдается обратная
картина. Следовательно, указанное отношение может служить весьма
чувствительным индикатором окислительно-восстановительного состояния
митохондрий [15]. Оно не подвержено тем нежелательным эффектам, о которых
мы говорили выше, поскольку оба компонента изменяются в одинаковой
степени, а их отношение сохраняется. Альтернативный подход к учету
поглощения пигментов крови состоит в коррекции флуоресценции, т. е.
определении разности между измеряемой интенсивностью флуоресценции и
интенсивностью отражения (возбуждающего света). В этом случае уменьшение
