Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
возбуждения из-за поглощения света пигментами крови приводит к уменьшению
интенсивности отраженного света, которое компенсирует уменьшение
флуоресценции. Адекватность данной процедуры была продемонстрирована на
перфузированных системах, в которых кровь заменяли прозрачным раствором
[16], но насколько она применима к экспериментам in vivo - не совсем
ясно.
Возбуждающий свет может поглощаться флуорофором настолько сильно, что по
мере его прохождения через образец, интенсивность флуоресценции будет
падать. Это одно из проявлений так называемого эффекта внутреннего
фильтра [4, 12]. На существование подобного эффекта может указывать
начальное увеличение флуоресценции при разбавлении образца. Он
проявляется, например, в том случае, если детектор регистрирует свет,
испускаемый лишь определенной частью образца, до которой возбуждающий луч
доходит только в разбавленных растворах. Рис. 7.2 иллюстрирует этот
эффект на примере простого эксперимента, который можно провести с любым
флуори-метром. Ожидаемая линейная зависимость между интенсивностью
флуоресценции и концентрацией наблюдается только в разбавленных (<Ю-3 М)
препаратах [4]. Следует помнить, что возбуждающий свет может поглощаться
не только данным флуорофором, и чтобы избежать эффектов внутреннего
фильтра, необходимо поддерживать низким именно общее поглощение образца.
Эффекты внутреннего фильтра можно уменьшить, изменив геометрию
эксперимента: флуоресценция с поверхности сильно поглощающего образца
значительно менее чувствительна к этим эффектам, поскольку ни
возбуждающий, ни испускаемый свет в этом случае не должен проходить всю
толщу непрозрачного образца. Так, если для возбуждения использовать
микроскоп с флуоресцентной приставкой, то эффективная длина оптиче-
318
Глава 7
ского пути составит величину порядка нескольких микрон и эффект фильтра
будет мал. Поэтому сравнение результатов, полученных с помощью
микроскопа, с результатами, полученными на стандартном флуориметре, не
всегда бывает правомочным. Цпаниновые красители очень эффективно
поглощаются митохондриями in vivo [5], что приводит к тушению
флуоресценции, регистрируемой в суспензии клеток [17]; однако во
флуоресцентном микроскопе митохондрии выглядят как ярко флуоресцирующие
нитевидные структуры [5]. Аналогично накопление кислыми эндосомами
акридинового оранжевого и
9-амнноакридина приводит к тушению их голубой флуоресценции; во
флуоресцентный же микроскоп они видны как желтые илн оранжевые везикулы -
цвет, характерный для спектра испускания очень концентрированных
растворов данных красителей [4].
2.4.3. Образование комплексов
Выбранный для исследований краситель может взаимодействовать с
компонентами системы, что естественно вызовет изменение их свойств. Так,
значение рКг pH-индикаторов в рас-
( i < I
Детектор | 1.J Г"1 L-J
Разведение 1 1/2 т 1/е
Детектор I Ш *3" gfeii
Разведение 1/1Б '1/32 1/БЧ 1/128
Рис. 7.2. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоро-
фора. В кварцевую кювету (при измерении флуоресценции необходимо
использовать кюветы, все стенки которых прозрачны) был залит 1 мМ раствор
9-ами-ноакридина в дистиллированной воде. Флуоресценцию измеряли на
флуоресцентном спектрофотометре Perkin-Elmer MPF 44А. Длина волны
возбуждающего света 410 нм, ширина щели 6 нм. Кювету помещали в кювет-ное
отделение и открывали шторку для прохождения возбуждающего света при
закрытой шторке для испускаемого света; лучше проводить измерения в
темной комнате. Та область, в которой наблюдалась голубая флуоресценция
9-аминоакридина, отмечена точками. Детектор регистрировал только свет,
испускаемый небольшим объемом раствора в центре кюветы (квадрат). При
уменьшении концентрации 9-аминоакридина путем последовательного
разбавления раствора область, где наблюдалась голубое свечение,
постепенно увеличивалась. Направление возбуждающего света указано
стрелкой.
Оптическая спектроскопия биологических мембран
319*
творе вовсе не обязательно равно рКа для индикатора, связанного с
клеточными или иными компонентами (см., например, работы [18, 19]);
спектры связанного и свободного красителя могут различаться, что
затрудняет оценку величины pH. Краситель может быть удобен как
качественный индикатор исследуемого параметра, но калибровка его
характеристик затрудняется тем, что он образует комплексы с агентами,
необходимыми для процедуры калибровки. Всегда полезно использовать
несколько независимых способов калибровки, чтобы убедиться во внутренней
непротиворечивости результатов. Так, при калибровке оптических зондов
мембранного потенциала [20, 21] должны получаться одни и те же значения
при использовании ва-линомицина/К+ или разобщителя карбонилцианид-п-
трифтор-метоксифенилгидразона/Н+.
2.5. Низкотемпературная спектроскопия
С уменьшением температуры образца изменяются и его поглощение, и его
флуоресценция, причем часто таким образом, что при этом
спектроскопические исследования упрощаются. При температуре жидкого азота
