Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
спектров (кривая 3) практически совпадает с базовой линией. Интересно,
что
Рис. 7.3. Спектры отражения замороженных почек крысы (способ получения
препаратов описан в тексте). Измерения проводили по схеме, представленной
на рис. 7.1,5 (см. также работу [25]); опорная длина волны - 700 нм.
Спектр отражения белого полистирола запоминался и использовался как
базовый. 1-естественно перфузированная почка; 2 - спектр почки через 1
мин после наложения лигатуры; 3 - разность между спектрами почек,
замороженных через 1 и 10 мин после наложения лигатуры. (Из работы [29],
с разрешения
авторов.)
21-1488
322
Глава 7
оксигемоглобин не полностью исчезает из ишемической ткани, т. е., по-
видимому, существуют некие метаболические компарт-менты, в которые
кислород доставляется, но не потребляется [28, 29].
Аналогичные эксперименты с замороженной корой головного мозга песчанки
([25, 30]; рис. 7.4) показывают, что восстановление митохондриальных
пигментов происходит только при полной аноксии. На рис. 7.4 приведен
разностный спектр отражения, полученный вычитанием спектра препарата,
изолированного из животного, которое дышало в течение 1 мин газовой
смесью, содержащей 5% кислорода, из спектра отражения коры головного
мозга животного, дышавшего 1 мин смесью без кислорода. В обоих случаях
гемоглобин был в значительной степени дезоксигенирован, и разностный
спектр целой ткани очень похож на разностный спектр окисленных и
восстановленных митохондрий. Это означает, что даже в условиях, когда
гемоглобин ткани почти полностью дезоксигенирован, для функционирования
дыхательной цепи все еще достаточно кислорода. Другими словами, in vivo,
как и in vitro, наблюдается огромная разница в сродстве митохондрий и
гемоглобина к кислороду.
Эксперименты, результаты которых представлены на рис. 7.3 и 7.4,
выполнены на двухволновом сканирующем спектрофотометре, снабженном
микропроцессором, который позволяет регистрировать, хранить и
обрабатывать спектры. Подоб-
Длина Волны, нм
Рис. 7.4. Разностный спектр отражения замороженной коры головного мозга
песчанки [301 - Мозг замораживали через 1 мин после того, как
анестезированное животное начинало дышать газовой смесью, содержащей 5%
02, 90% N2, 5% С02 или 95% N2, 5% С02. С помощью сканирующего
спектрофотометра, снабженного раздвоенным световодом (рис. 7.1 ,Б),
регистрировали спектры отражения коры правого полушария при 77 К и
получали разностный спектр
отражения.
Оптическая спектроскопия биологических мембран
323
ные приборы для измерения отражения выпускают фирмы Perkin Elmer (Lambda
5UV/Vis, спектрофотометр с наружной интегрирующей сферой) и Applied
Pliotopliysics Ltd., London.
3.2. Мембранный потенциал органелл и клеток
Большинство биологических мембран способны поддерживать разность
электростатического потенциала между водными фазами, которые они
разделяют. Этот потенциал, обычно называемый трансмембранным потенциалом,
часто играет очень большую роль в функционировании мембраны. Он,
например, весьма критичен для передачи сигнала возбудимыми клетками;
участвует в аккумуляции питательных веществ, переносимых через
плазматическую мембрану многих клеток за счет энергии электрохимического
градиента ионов Na+. В субклеточных ор-ганеллах - хлоропластах и
митохондриях - мембранный потенциал является важнейшим
"высокоэнергетическим" интермедиатом синтеза АТР. Прямая регистрация
потенциала с помощью микроэлектродов часто практически невыполнима,
поэтому трансмембранный потенциал измеряют косвенными методами; наиболее
популярные из них основаны на использованиии чувствительных к потенциалу
специфических красителей [31].
У очень многих красителей наблюдается изменение спектра поглощения или
флуоресценции в ответ на изменения трансмембранного потенциала [3], но
откалибровать эти изменения по известным потенциалам часто бывает
довольно трудно. Проще всего это сделать, увеличивая проницаемость
мембраны для определенных катионов, обычно К+ или Н+, путем добавления к
системе реагентов, называемых ионофорами. В присутствии соответствующего
ионофора при условии, что проницаемость для всех прочих ионов
относительно мала, мембранный потенциал V примерно определяется
уравнением Нернста
V= (- RT/F) In ([М+]в/[М+]н), (1)
где [М+] - концентрация соответствующего иона, R - газовая постоянная, Т-
абсолютная температура, F-постоянная Фарадея. При 37 °С это соотношение
сводится к виду
V (мВ) =-61,51g([M+]B/[M+]n), (2)
из которого следует, что при десятикратном увеличении или уменьшении
градиента концентрации катиона потенциал изменится на 61,5 мВ. Градиент
можно изменить, меняя концентрацию М+ в среде, а следовательно, в
присутствии ионофора можно получить калибровочную кривую - зависимость
оптического параметра от потенциала.
21
324
Глава 7
3.2.1. Индуцированный светом мембранный потенциал в хроматофорах
Хроматофоры, выделенные из фотосинтезирующих бактерий, представляют собой
идеальную модельную систему для изучения изменений мембранного
