Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
потенциала. Транспорт электронов в фотосинтетическом реакционном центре
"запускается" инфракрасным светом, и с помощью короткой интенсивной
вспышки света можно инициировать однократное срабатывание фотосин-
тетического аппарата, прн котором по электронтранспортной цепи происходит
перенос одного электрона. В результате электронного транспорта Н+-ионы
накачиваются внутрь хроматофо-ра и создается значительный мембранный
потенциал (до 300 мВ, "плюс" внутри). Последний в свою очередь вызывает
электрогеннын сдвиг полос поглощения каротиноидных пигментов. Этот
потенциалзависимый сдвиг можно откалибровать с помощью К+ в присутствии
ионофора валиномицина ([2]; см. разд. 3.2.2).
На рис. 7.5 приведен разностный спектр "свет минус темнота" суспензии
хроматофоров R. sphaeroides, содержащей индикатор мембранного потенциала
- оксонол-VI. Минимум при 590 нм и максимум при 630 нм связаны с
"красным" сдвигом полос поглощения оксонола (в отсутствие красителя при
данной чувствительности спектр хроматофоров не имеет в этой области
характерных особенностей), а максимум и минимум между 400 и 520 нм - с
"красным" сдвигом полос поглощения ка-ротиноидов. Таким образом, как
внутренние, так и наружные хромофоры реагируют на трансмембранный
потенциал, причем по первым можно судить о свойствах вторых. Детальное
изучение этой системы [32] позволило установить механизм ответа оксонола
на потенциал: вначале краситель мигрирует внутрь хроматофора
[распределение красителя в толще мембраны подчиняется уравнению (1)]. а
затем связывается с гидрофобными сайтами. Именно по такой схеме работают
многие из наиболее широко используемых оптических индикаторов мембранного
потенциала. Изменение поглощения оксонола в этой системе пропорционально
логарифму трансмембранного потенциала.
3.2.2. Потенциал плазматической мембраны животных клеток
Мембранный потенциал целых клеток в отличие от изолированных органелл
оценить с помощью оптических индикаторов значительно сложнее, поскольку
клетки содержат множество субклеточных компартментов и необходимо
дифференцировать изменения оптических свойств, связанные с состоянием
плазматической мембраны и любой другой мембранной структуры. Например,
интенсивное окрашивание митохондрий цианиновыми
Оптическая спектроскопия биологических мембран
325
красителями [5]-проникающими через мембрану катионами- означает, что,
если для измерения потенциала плазматической мембраны выбраны цианиновые
красители или иные лн-пофильные катионы, нужно позаботиться, чтобы
митохондриальная мембрана была незаряжена. Если использовать краситель
анионной природы, эта проблема не возникает, но зато появляется новая:
анионы, даже довольно липофильные, плохо проникают внутрь клетки. Поэтому
для изучения целых клеток, как и хроматофоров, мы используем оксонол, но
не пропильное, а фенильное производное. На рис. 7.6 проиллюстрирована
процедура измерения потенциала плазматической мембраны с помощью
индикатора оксонола-V [33].
M~j~.у волны, Ht-1
Рис. 7.5. Разностный спектр "свет минус темнота" хроматофоров из R.
sphaeroi-des в присутствии оксонола-VI. Хроматофоры выделяли из клеток R.
sphaeroi-des GA [68] и суспендировали (конечная концентрация
бактериохлорофилла 2,1 -10-5 М) в среде, содержащей 100 мМ КС1, 20 мМ
морфолинопропансульфо-иат (MOPS), 1 мМ MgCl2, 0,5 мМ аскорбат, 1,5-10-6 М
оксонол-VI; pH доводили с помощью КОН до 6,9 при 23 °С [32]. Спектр
поглощения суспензии регистрировали, используя в качестве опорной длину
волны 670 им, и хранили в памяти ЭВМ двухлучевого спектрофотометра фирмы
Johnson Foundation Scanning [25,69]; интенсивность света, использующегося
при измерениях, была недостаточна для возбуждения фотосинтеза. Второй
спектр регистрировали, освещая образец в направлении, перпендикулярном
направлению регистрации, лампой накаливания мощностью 15 Вт. Возбуждающий
свет нужной длины волны (>750 нм) получали, пропуская свет через красный
светофильтр (№ 88A, Kodak Wratten Gelatin). Инфракрасный свет активировал
фотосинтез и не мешал регистрации спектра в области между 400 и 670 им
благодаря низкой чувствительности фотоумножителя к ИК-свету. Третий
спектр записывали и запоминали с помощью компьютера после выключения
инфракрасного освещения. Представлены два разностных спектра: спектр 1
минус спектр 3 - базовая линия без каких-либо максимумов или минимумов,
что свидетельствует об отсутствии индукции фотосинтеза измеряющим светом;
спектр 2 минус спектр 1 - разностный спектр "свет минус темнота".
Максимум и минимум между 550 и 670 нм обусловлены энергозависимым сдвигом
спектра поглощения оксонола-VI в красную область; максимумы и минимумы
между 400 и 520 им отражают зависимый от траисмембранного потенциала
сдвиг полос поглощения каротнноидных пигментов [32]. (Из работы [32] с
разрешения
авторов.)
22-1488
326
Глава 7
1. Клетки суспендируют в физиологическом растворе при 37 °С в присутствии
красителя (сыворотки или иные альбумин-содержащне среды использовать не
